小學(xué)教師教研工作總結(jié)張富
小學(xué)教師教研工作總結(jié)
一期來，我兢兢業(yè)業(yè)，踏踏實實，根據(jù)期初的教學(xué)工作計劃，以新課程改革為契機，以新課程標(biāo)準(zhǔn)的基本理念為指導(dǎo)，轉(zhuǎn)變教學(xué)觀念，有目的，有計劃，有步驟地進行課程改革。本著科研先導(dǎo)，以研促教，教為學(xué)服務(wù)的研究宗旨，堅持不懈地抓住新課程改革這一契機，有條不紊的開展各項教學(xué)教研活動，順利地完成了本學(xué)期的教育教研任務(wù)，實現(xiàn)了學(xué)期初制定的教學(xué)目標(biāo)。為了更好地完成今后教育教研工作，使教學(xué)工作做到有的放矢，特對本學(xué)期的教研工作總結(jié)如下：
一、制訂切實可行的教研計劃
為了做好本期的教研工作，有的放矢，我們開學(xué)伊始，計劃先行。我根據(jù)教育教學(xué)現(xiàn)狀，認(rèn)認(rèn)真真地權(quán)衡利弊，制訂出切實可行的教研計劃。二、狠抓有效課堂教學(xué)
根據(jù)縣教研室的要求和我班的教育教學(xué)現(xiàn)狀，采取有效措施狠抓有效課堂教學(xué)。領(lǐng)會新大綱和新課程標(biāo)準(zhǔn)的精神實質(zhì)把握教材的特點，制定出切實可行的教學(xué)工作計劃。做到集體備課與獨立備課相結(jié)合，高標(biāo)準(zhǔn)地完成單元備課和課時備課，及時對全冊教材進行集體教研和教學(xué)方法的探討，明確教學(xué)思路。積極參加各種教研活動，觀摩學(xué)習(xí)，及時進行了教研探討，并把學(xué)習(xí)到的教育新理念運用到自身的教學(xué)活動中，做到本校互聽、校際交流、外出觀摩，做到聽課不少于20節(jié)。三開展活動促教學(xué)
為了全面提高素質(zhì)教育，讓教師和學(xué)生都有所發(fā)展，我積極參加各種教研活動。本期參加的教育教研活動主要有：校際教研交流活動、電化教學(xué)公開課、作文改革公開課、復(fù)習(xí)研討課、語文青年教師比武課、有效課堂送下村、還舉行了三年級學(xué)生語文知識綜合競賽、小學(xué)生讀書活動演講，從多方面開展素質(zhì)教育。四、抓常規(guī)保質(zhì)量
為盡可能地提高教育教學(xué)質(zhì)量，我從教學(xué)計劃到備課到上課到課后反思、批改作業(yè)、校本培訓(xùn)都進行了具體的實施。段考后對自己進行一次教學(xué)常規(guī)檢查。
五、加強學(xué)習(xí)提高自身素質(zhì)
學(xué)無止境，為自己能更好地為教育服務(wù)，展現(xiàn)教師的人生價值，我常常教導(dǎo)自己要有終身學(xué)習(xí)的觀念，平時多讀書看報，有機會多學(xué)習(xí)取經(jīng)，鼓勵自己
多寫心得體會、教學(xué)所見所感、教育教學(xué)論文，不斷地提高自身素質(zhì)。
擴展閱讀：12484040 張富
編號（學(xué)號）：12484040
畢業(yè)論文
（201*屆本科）
題目：小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進化分析學(xué)院：生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院專業(yè)：生物技術(shù)姓名：張富指導(dǎo)教師：郭志富完成日期：201*年06月08日
畢業(yè)論文任務(wù)書
論文題目學(xué)生姓名下發(fā)任務(wù)小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進化分析日期張富指導(dǎo)教師201*年6月郭志富一.論文主要內(nèi)容根據(jù)已有小麥近緣屬種重結(jié)晶抑制蛋白基因（IRI），設(shè)計引物，對小麥野生近緣屬種山羊草、偃麥草、Thinopyrumpycnanthum等IRI基因進行克隆、測序鑒定以及不同種屬的IRI基因進行彼此的差異化分析、進化分析，達到對IRI基因的全面的分析，為今后挑選抗凍性最強的IRI基因轉(zhuǎn)移道小麥品種等作物中從而提高其抗凍性奠定理論基礎(chǔ)。二.論文的基本要求1、學(xué)習(xí)掌握生物學(xué)文獻的檢索技能，查閱相關(guān)資料，撰寫文獻綜述。2、掌握組培技術(shù)、DNA提取實驗技術(shù)及NCBIBLAST的使用。3、熟練使用引物設(shè)計軟件，操作PCR儀和連接、克隆、多序列分析。4、能夠通過自己設(shè)計的實驗，撰寫畢業(yè)論文，不少于10000字。5、能熟練閱讀與實驗相關(guān)的中、英文文獻。
三.論文工作進度安排階段123456備注：四.應(yīng)收集的資料及主要參考文獻（指導(dǎo)教師指定）1.周筱娟.低溫誘導(dǎo)的植物抗凍基因研究進展[J].紹興文理學(xué)院學(xué)報.第24卷第9期201*年9月2.NovilloF。AlonmJM．ColdacclimationofArabidopaisthalLana：Affectonplasmamembranelipidcompositionandefreeze-inducedlesions[J]．PlantBiology，201*(11)139853990．3.SteponkusPLRoleofplamaamembraneincoldacclimationandfreezinginJuryInplants．Amlu.Rev[J]．PlantPhysi01．1984．35：543584．4.HughesMA，DunnMA．Themolecularbiologyofplantacclimationtolowtemperature．JExpBot，1996，47：29l8055.GibsonS，ArondelV．Cloningofatemperatureregulatedgeneencodingachloroplastω-3desaturasefromArabidopsisthaliana.PlantPhvsiol。1994，106：1615～162l6.Liansenliu,MichaeJ.White,ThornasH.MacRae.Eur.JBiochem.1999,262,247~2577.黃文功.殷奎德.高中超-植物抗凍基因工程研究進展生物技術(shù)通報，201*年第2期8.劉曉丹.李海燕-CBF轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)。JournalofAnhuiAgri．5ci．201*．37{32}：1574915751論文各階段名稱閱讀文獻，查找相關(guān)資料實驗所需材料的整理材料DNA提取PCR擴增及克隆測序處理數(shù)據(jù)、分析結(jié)果畢業(yè)論文成稿日期201*.06201*.06201*.06201*.06201*.12201*.01201*.05201*.05201*.
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文選題審批表
選題名稱學(xué)號小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進化分析姓名郭志富張富專業(yè)職稱題目來源教師擬定（b）生物技術(shù)講師12484040指導(dǎo)教師對偃麥草屬、山羊草屬、冰草、黑麥草屬等小麥野生近緣屬種材料提取DNA，利用研NCBI已有小麥屬IRI蛋白基因同源引物克隆新的IRI基因，并連接到載體上，轉(zhuǎn)化大腸究桿菌后進行陽性克隆篩選，測序后進行序列比對和進化分析。內(nèi)容論文題目選定，資料查閱；準(zhǔn)備實驗材料及試劑藥品；進行前期準(zhǔn)備工作；研究提取材料DNA，進行PCR擴增并回收、克隆測序；計數(shù)據(jù)分析處理；劃撰寫論文。本實驗在集中于發(fā)現(xiàn)多個小麥近緣屬種中的IRI基因，并進行了不同品種間IRI基特因序列差異性分析和分子進化分析。為挑選、鑒定抗凍性最強的IRI基因的篩選以及后色續(xù)的轉(zhuǎn)基因的工作奠定理論基礎(chǔ)。指導(dǎo)教師意見教研室意見學(xué)院意見
畢業(yè)論文指導(dǎo)記錄
學(xué)生姓名指導(dǎo)教師姓名論文題目時間學(xué)生簽字：年月日指導(dǎo)教師簽字：年月日教研室主任簽字：年月日張富郭志富專業(yè)職稱講師生物技術(shù)本年度指導(dǎo)畢業(yè)生人數(shù)5小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進化分析地點指導(dǎo)內(nèi)容
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文考核表
論文題目：小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進化分析姓名：張富學(xué)號：12484040專業(yè)：生物技術(shù)指導(dǎo)教師評語：指導(dǎo)教師（簽字）：年月日評閱人評審意見：評閱人（簽字）：年月日答辯委員會意見：成績：主任委員（簽字）：年月日
目錄
摘要.............................................................................................................................................................1Abstract...........................................................................................................................................................2前言.............................................................................................................................................................31.IRI蛋白的研究概述...................................................................................................................................3
1.1抗凍蛋白（AFPs）的特性.............................................................................................................41.2植物AFPs發(fā)現(xiàn)...............................................................................................................................41.3植物IRI蛋白的理化性質(zhì)及特征...................................................................................................41.4植物AFPs的結(jié)構(gòu)模型特征...........................................................................................................51.5抗凍蛋白的作用機理......................................................................................................................61.6AFPs的研究意義和應(yīng)用.................................................................................................................61.7植物AFPs的研究現(xiàn)狀...................................................................................................................72.材料、試劑................................................................................................................................................9
2.1材料及處理......................................................................................................................................92.2菌株與載體......................................................................................................................................92.3酶與試劑.........................................................................................................................................92.4實驗相關(guān)儀器及生物軟件............................................................................................................102.5相關(guān)試劑的配制............................................................................................................................103.實驗方法與步驟......................................................................................................................................12
3.1植物基因組DNA的提�。ㄖ参锘蚪MDNA提取試劑盒）...................................................123.2IRI基因的PCR擴增.....................................................................................................................123.3目的片段與載體連接....................................................................................................................133.4轉(zhuǎn)化................................................................................................................................................143.5陽性克�。核{白斑篩選................................................................................................................143.6菌落PCR.......................................................................................................................................143.7搖菌測序........................................................................................................................................154．實驗結(jié)果與分析.....................................................................................................................................15
4.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測....................................................................................................154.2測序結(jié)果及分析............................................................................................................................164.3測序結(jié)果的DNA多序列比多和氨基酸序列比對分析..............................................................174.4IRI的進化分析...............................................................................................................................205．討論.....................................................................................................................................................23參考文獻.......................................................................................................................................................25致謝.........................................................................................................................................................27
":null,"page":{"ph":1262.879,"pw":892.979,"v":6,"t":"1","pptlike":null,"cx":0,"cy":0,"cw":892.979,"ch":1262.879}})沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
摘要
小麥野生近緣屬種中蘊含豐富的抗性資源，是小麥遺傳改良的天然基因庫。重結(jié)晶抑制蛋白(IceRecrystallizationInhibitionprotein，IRI)能結(jié)合于冰晶表面阻止冰晶生長，從而提高植物抗寒能力。在小麥野生近緣屬種中廣泛分離IRI基因，并對其進行功能分析，對后續(xù)篩選優(yōu)勢IRI基因轉(zhuǎn)入到小麥等作物品種從而提高抗寒力具有重要意義。本文主要研究結(jié)果如下：
(1)在5個小麥野生近緣屬材料中，克隆得到編號為B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21共8個序列具有典型IRI基因的保守區(qū)特征，同時在氨基酸組成上存在一定的結(jié)構(gòu)差異。(2)在所得IRI基因中，DNA序列最短的為849bp，最長為864bp，其中B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25編碼的氨基酸總數(shù)分別為287、283、286、288、284、285、288、284。(3)B24和W25基因末端由于堿基的缺失，導(dǎo)致移碼突變，使得后續(xù)氨基酸突變，該突變可能引起IRI蛋白的功能的改變。
(4)B25基因編碼的半胱氨酸只有3個，為奇數(shù)個，而其余的7個基因編碼的半胱氨酸均為4個，是偶數(shù)個。該氨基酸的突變是由于單堿基置換引起的，推測可能會影響IRI蛋白的功能。
(5)進化分析表明，不同材料中克隆出的IRI基因親緣關(guān)系可能比同一材料中的更近，說明IRI基因家族存在較為豐富的變異，推測可能是在植物長期進化過程中不斷適應(yīng)低溫變化而調(diào)整自身基因結(jié)構(gòu)從而適應(yīng)低溫環(huán)境的原因。
關(guān)鍵詞：重結(jié)晶抑制蛋白；低溫；抗凍蛋白；小麥野生近緣屬種；克隆；進化分析
1小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
Abstract
Thewildrelativesofwheatarespeciescontainsrichresourcesofresistanceisthenaturalgenepoolforwheatimprovement.Recrystallizationinhibitionprotein(IceRecrystallizationInhibitionprotein,IRI)cancombinetopreventthegrowthoficecrystalsintheicesurface,therebyimprovingplantcoldtolerance.IRIgeneinthewildrelativesofwheatspecieswidelyseparated,andfunctionalanalysis,andfollow-upscreeningadvantageIRIgeneintothewheat,andothercropvarieties,therebyenhancingthecoldhardinessofgreatsignificance.
Inthispaper,resultsareasfollows:
(1)infivewildrelativesofwheatmetallicmaterials,theclonednumberB2A,B2B,B15C,B24,B25,W15,W17,W218sequencestypicalIRIgenesconservedregioncharacteristics,whileintheaminoacidcompositiontherearesomestructuraldifferences.
(2)theproceedsofIRIgenes,DNAsequencesaretheshortest849bp,upto864bp,ofwhichthetotalnumberofB2A,B2B,B15C,B24,B25,W15,W17,W25-encodedaminoacidswere287,283,286,288,284,285,288,284.
(3)theendoftheB24andW25genebasedeletion,resultinginframeshiftmutation,makingthesubsequentaminoacidmutations,themutationsmaycausefunctionalchangesofIRIprotein.
(4)B25geneencodingthecysteine3isanoddnumber,whiletheremainingsevengenesencodingcysteineare4,isanevennumber.Theaminoacidmutationsarecausedbysinglebasesubstitutions,suggestingthatmayaffectthefunctionoftheIRIprotein.
(5)ThephylogeneticanalysisshowedthatclonedindifferentmaterialsIRIgenephylogeneticrelationshipmaybecloserthaninthesamematerial,indicatingthattheIRIgenefamilythereismorevariation,andspeculatedthatitmightcontinueinthelong-termevolutionaryprocessofplantadaptationtolowtemperaturechangesadjustitsgenestructuretoadapttothereasonsofthelow-temperatureenvironment.
2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
前言
植物在為了適應(yīng)環(huán)境而進化出不同的抗性條件。植物生長發(fā)育過程中，溫度作為一個重要的環(huán)境因子對其生長、生殖和分布起著關(guān)鍵的作用。溫度的不同導(dǎo)致植物在不同地區(qū)分布不同的主要原因之一，低溫不僅在很大程度上限制植物的種植范圍，同時還會造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時甚至絕收。根據(jù)植物對低溫的反應(yīng)差異，可以將植物簡要分為兩類：一類是耐寒能力弱或不能耐寒的植物，也稱冷敏感植物；另一類是抗寒植物，也稱冷不敏感植物。不抗寒植物主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，10～12℃的非冰凍低溫即可引起對植物生命活動的傷害，而抗寒植物生長于溫帶、寒帶地區(qū)，在長期的進化過程中形成了低溫相應(yīng)的抵抗能力，但在不同植物之間抗寒能力強弱上存在差異[1，2]。
就小麥這一品種作物而言，生長在我國南方的小麥和生長在我國北方的小麥表現(xiàn)了不同差異。南方的小麥處于溫和的地區(qū)，沒有低溫寒害的環(huán)境，小麥存活而產(chǎn)量高。相比較而言，北方的小麥耐寒的能力相對較強，但是依舊會面著驟降低溫寒害。但是，由于南方的小麥不具抗寒能力，將南方的小麥移植到北方從而提高北方小麥的產(chǎn)量的想法卻沒有成功，此外，北方的的小麥的抗寒能力也有限。小麥?zhǔn)侨蚍N植總產(chǎn)量第二的糧食作物，僅次于玉米，每年因為低溫寒害而造成的小麥損失達數(shù)千億美元，所以提高小麥的抗寒能力尤為重要。所以，通過研究小麥野生近緣屬種植物中抗寒能力最強的植物，將其對抗寒能力起著重要作用的的相關(guān)基因克隆出來，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移到小麥等相關(guān)的作物中提高作物的抗寒能力，免受或降低低溫的損害從而提高小麥的產(chǎn)量相當(dāng)重要。
在長期的進化過程中，植物形成的抗凍蛋白具有抗凍、抗病雙重功能。植物抗凍蛋白提高植物抗凍性的主要途徑不是阻止冰晶的形成，而是調(diào)控胞外冰晶的增長及抑制冰的重結(jié)晶，避免冰晶增大而產(chǎn)生致死性的機械損傷[3,4]．IRI蛋白是具有重結(jié)晶抑制活性的AFP蛋白，主要分布于南北回歸線以外高緯度地區(qū)以及高山高寒區(qū)，常見的有高山雪蓮、胡蘿卜[5]、黑麥草[6]、沙生冰草[7]、沙冬青[8]等，它們共同的特點是都經(jīng)過冷誘導(dǎo)，IRI蛋白表達從而提高植物的抗寒性。
1.IRI蛋白的研究概述
抗凍蛋白(antifreezeproteins，AFPs)是1969年Devrjes在南極Mcmurdo海峽的一種Nototheniid魚的血液中首次發(fā)現(xiàn)的，它是生物體在受凍害脅迫時產(chǎn)生并籍此防止細(xì)胞免受冰凍傷害．AFPs已經(jīng)在多種冰凍耐受機體中發(fā)現(xiàn)，包括魚類、昆蟲、陸生節(jié)肢動物、細(xì)菌、真菌和植物．其中，有關(guān)植物AFPs的研究起步較晚，20世紀(jì)90年代初
3小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
期才開始研究植物中的AFPs．近年來，AFPs的研究已取得重大進展，成為生命科學(xué)中較為活躍而且發(fā)展迅速的課題之一．
1.1抗凍蛋白（AFPs）的特性
抗凍蛋白是一類抑制冰晶生長的蛋白質(zhì)，它能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點而對其熔點影響甚微，于是導(dǎo)致水溶液的熔點(meltingpoint，MP)和冰點(freezingpoint，F(xiàn)P)之間出現(xiàn)差值，這種差值稱為熱滯活性(thermalhysteresisactivity，THA)，因而抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白(thermalhysteresisproteins，THPs)。AFPs從發(fā)現(xiàn)至今，有兩個特性，其中之一是產(chǎn)生熱滯效應(yīng)．一般溶液(如Nacl，蔗糖溶液等)的冰點是固、液兩相蒸氣壓平衡時的溫度，因而冰點應(yīng)等于熔點．但是AFPs這類大分子只影響結(jié)冰過程，幾乎不影響熔化過程，使冰點低于熔點，這種現(xiàn)象叫做熱滯效應(yīng)．熱滯是一種非理想溶液的行為，AFPs的冰點不由溶液的依數(shù)性決定，而它的熔點卻由溶液的依數(shù)性決定，使二者出現(xiàn)差值，冰點和熔點的差值稱為熱滯值[10]．AFPs的另一個特性是抑制冰晶的重結(jié)晶，AFPs通過抑制冰晶的重晶化，防止小的冰晶結(jié)成更大的冰晶，使形成的冰晶小且均勻．因此，它可以減輕冰晶在凍融的動態(tài)變化中對生物體的傷害．AFPs的上述特性都是通過AFPs與冰晶的表面相互作用而實現(xiàn)的。以上兩個特性可作為判定AFPs的依據(jù)。
[9]
1.2植物AFPs發(fā)現(xiàn)
Griffithetal.[11]1992年第一次明確提出已經(jīng)獲得植物植物內(nèi)源AFPs，從經(jīng)低溫有道忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥(SecalecerealeL．)葉片質(zhì)外體中得到并部分純化了該蛋白，Dumanetal．[12]多種植物中發(fā)現(xiàn)了具有熱滯效應(yīng)的蛋白質(zhì)，并從千年不爛心(Solanumdulcamara)的冬季枝條中分離到分子量為67kD的抗凍糖蛋白[13]。1994年，費云標(biāo)等[14]從強抗凍植物沙冬青(Ammopiptanthusmonglicus)葉片中發(fā)現(xiàn)AFPs,隨后，越來越多的抗凍蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)。
1.3植物IRI蛋白的理化性質(zhì)及特征
Griffithetal.[11]于1992年從冬黑麥(SecalecerealeL．)的質(zhì)外體中分離和純化了AFPs的研究表明冬黑麥的AFPs包括7個AFPs(分子量從1l～36kD)，這些蛋白存在著彼此的相似氨基酸組成，均富含Asp／Asn，Glu／Gln，ser，Thr，Gly，Ala，均缺少His，Cys含量達5％以上．而且Western印跡分析表明，植物冬黑麥的AFPs同魚及昆蟲富含Cys的AFPs沒有共同的抗原決定簇．1994年費云標(biāo)等[14]從強抗凍植物沙
4沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
冬青(Ammopiptanthsumongolicus）中發(fā)現(xiàn)AFPs，接著他們從沙冬青葉片中分理出AFPs，其中一種為熱穩(wěn)定的抗凍糖蛋白AFPs，分子量為40kD，熱滯活性為0．9℃(20mgmL-1)，和其它AFPs進行比較，沒有發(fā)現(xiàn)相同的類型，測定其N一端20個氨基酸為SDDLLFNKFVPCQTDILF，表明它與植物凝集素具有同源性[15]．另外3種不是糖蛋白，它們分別為：分子量67kD，熱滯活性O(shè)．46℃(8mgmL-1)，分子量2lkD．熱滯活性0。46℃(8mgmL-1)分子量39．8kD．熱滯活性0．45℃(10mgmL-1)[16]．Sidebottometal[17]從一種越冬的多年生黑麥草(Loliumperenne)中發(fā)現(xiàn)了一種熱穩(wěn)定性的AFPs，這種蛋白由118個氨基酸組成，100℃時仍穩(wěn)定存在，熱滯效相對較低，但對球晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)是魚的AFPs(TypⅢ)的200倍．因此，在低溫條件下，推測冬麥草AFPs的重結(jié)晶抑制效應(yīng)可能是細(xì)胞避免冰凍損傷的重要生理基礎(chǔ)．
綜合已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物AFPs，發(fā)現(xiàn)具有以下特點：
(1)不同植物的AFPs的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上差別很大，表現(xiàn)在氨基酸序列相似性低。雖然其在DNA和氨基酸水平上完全不同(幾乎沒有同源性)但卻擁有相似的高級結(jié)構(gòu)，冰晶結(jié)合位點也有一定的相似性。而且都可以通過表面互補模型較好地解釋它們與冰晶之間的相互作用,但植物的AFPs表面互補模型也存在很多問題(如至今還無法確定表面互補模型中到底含有多少種作用力的存在），每種作用力的貢獻程度和作用方式更是需要進一步的研究[18，19]�，F(xiàn)在一般認(rèn)為范德華力和疏水作用可能起著主要的作用，氫鍵起著輔助的作用。
(2)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物AFPs不僅僅只具有抗凍活性，還存在酶功能(如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶[18]，內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶)，抗菌功能(如甜味蛋白等)和抗蟲功能(植物凝集素)，抗旱功能(植物脫水素)等活性；
(3)總體上已發(fā)現(xiàn)的大部分植物AFPs的熱滯活性都大大低于魚類和昆蟲AFPs的熱滯活性，但也有例外，有些植物(如黑麥草)的AFPs的冰晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)遠遠大于魚類和昆蟲AFPs，表明了植物AFPs存在的多樣性。所以，推測植物AFPs提高本身的抗凍性的主要途徑不是通過阻止冰晶形成，而是通過控制冰晶增長和抑制冰晶重結(jié)晶效應(yīng)；
(4)植物的AFPs表達除了被低溫誘導(dǎo)外，還能被其它外因影響，如干旱[19]，外源乙烯
[20]
(可誘導(dǎo)冬黑麥的AFPs)，脫落酸
[21]
等也可誘導(dǎo)植物AFPs的產(chǎn)生。推測植物的AFPs
可能還有其它方面的功能。
1.4植物AFPs的結(jié)構(gòu)模型特征
由于最初發(fā)現(xiàn)的AFPs來自魚類，所以有關(guān)魚類AFPs的結(jié)構(gòu)模型的研究較多，但是與植物相關(guān)的的AFPs研究相對較晚，而且植物的AFPs存在較大的差異性，所以植物相關(guān)的AFPs研究較少。201*年Kuiperetal.[22]在研究多年生黑麥草的AFPs的中發(fā)現(xiàn)
5小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
其抑制活性高，熱滯活性低，而且其一級結(jié)構(gòu)中含有重復(fù)性的序列。他們從理論提出了一種三維結(jié)構(gòu)模型：在獲得的包含個118個氨基酸的AFPs的多肽中，每14～15個氨基酸組成一個環(huán)，8個這樣的環(huán)組成一個β-筒狀結(jié)構(gòu)，β-筒狀結(jié)構(gòu)的一端是保守的纈氨酸疏水核，另一端是由內(nèi)部天冬酰氨組成的梯狀結(jié)構(gòu)。已知纈氨酸是疏水性氨基酸，天冬酰氨是親水性氨基酸；β-筒狀結(jié)構(gòu)的親水端與冰晶表面吻合互補，疏水端則有效地防止了水與冰晶的結(jié)合，阻止了冰晶繼續(xù)生長。這個模型很好地解釋了植物AFPs熱滯活性低、冰重結(jié)晶抑制活性高的現(xiàn)象。
1.5抗凍蛋白的作用機理
（1）熱滯效應(yīng)。大量研究發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白降低溶液冰點的效率比一般溶質(zhì)要高。在較低濃度下，抗凍蛋白降低溶液冰點的效應(yīng)隨其濃度增加而增強，在較高濃度下，這種效應(yīng)逐漸趨于飽和�？箖龅鞍椎男�(yīng)可與NaCl等溶質(zhì)的效應(yīng)相加而共同使冰點大幅度降低，以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點，對熔點影響很小，所以導(dǎo)致水溶液的熔點和冰點出現(xiàn)差值。這種現(xiàn)象叫做熱滯效應(yīng)，因而抗凍蛋白也被稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白[23]。
（2）冰晶形態(tài)效應(yīng)�？箖龅鞍啄芤种票L，而且這種抑制作用在不同的方向上有強弱之分，進而引起冰晶形態(tài)的改變。冰通常以平行于晶格基面(a軸)的方式生長，在垂直基面(c軸)很少生長，因此冰晶格呈扁圓狀。低濃度的抗凍蛋白優(yōu)先抑制冰沿a軸生長，因此冰晶格的六邊柱表面變得明顯。而在高濃度的抗凍蛋白下，冰晶格主要沿c軸生長，形成六邊雙棱錐及針形晶體。有研究者認(rèn)為，抗凍蛋白的這種作用，可以在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)胞外冰晶的生長形態(tài)，以盡量避免冰晶對細(xì)胞膜造成機械損傷[24]。（3）抑制冰晶的重結(jié)晶。重結(jié)晶是指在已經(jīng)形成的晶體顆粒之間進行生長重分配，大的愈大，小的愈小。這種情況多發(fā)生在溫度波動之時，往往對植物體細(xì)胞造成致命傷害。而抗凍蛋白具有抑制重結(jié)晶的作用，所形成的晶體體積小而比較均勻。抑制冰的重結(jié)晶對于某些生物特別是耐凍生物具有更重要的意義，而且引人注意的就是重晶化的抑制作用比冰晶生長的抑制作用更容易達到，即只需要少量抗凍蛋白(20μgmL-1)，就有較高的重結(jié)晶抑制活性
[25]
。所以，通過克隆出能被冷誘導(dǎo)表達的IRI基因，通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)移到到所需作物中，誘導(dǎo)IRI基因的表達從而提高作物的抗凍能力。
1.6AFPs的研究意義和應(yīng)用
植物抗冰凍存在著多種機制，抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)和研究揭示了植物抵御低溫的又一途徑，為我們了解植物的抗凍作用原理提供了新的思路，同時也為生產(chǎn)實踐提供了理論依
6沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
據(jù)。
農(nóng)業(yè)上，從1998年，worralletal[26]從胡蘿中發(fā)現(xiàn)第一個植物AFPs基因后，獲得其cDNA并將其連接道表達載體的雙CAMV35s啟動子之后導(dǎo)人煙草，讓其組成性表達，對其進行抗凍功能驗證。此外，還用蛋白質(zhì)免疫雜交法進行檢測，發(fā)現(xiàn)了AFPs在煙草已表達。同時，將這些表達的AFPs進行提取，發(fā)現(xiàn)含有胡蘿卜AFPs的煙草提取物可以抑制冰晶的生長。由于植物內(nèi)源AFPs基因更適合在植物體內(nèi)表達，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物在抗寒凍性改變將會更明顯。該實驗成果為后續(xù)將抗凍性強的植物中的AFPs蛋白通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移到小麥、玉米、水稻等作物或是植物奠定了理論基礎(chǔ)與實驗技術(shù)方案基礎(chǔ)，使農(nóng)作物提高自身的抗凍性進而提高糧食產(chǎn)量。
醫(yī)藥上主要將AFPs用于細(xì)胞、器官的超低溫保存。研究表明，AFPs可用于人和動物的卵、精子、胚胎或肝臟等器官的超低溫保存，從而改善其冷凍質(zhì)量[27]。此外，由于植物AFPs的多樣性，某些植物的AFPs冰晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)比動物AFPs大的多，所以植物AFPs在醫(yī)學(xué)上所起的作用將會更大。
由于AFPs在食品的冰凍、儲藏、運輸和解凍等過程中均能抑制重結(jié)晶化，并能減少滴液以防止?fàn)I養(yǎng)成分的損失[28]．食品上，植物AFPs已經(jīng)應(yīng)用于冷凍食品業(yè)如：冰淇淋[29]的制造和保存，冷凍肉[30]的保存等等。
1.7植物AFPs的研究現(xiàn)狀
植物體內(nèi)AFPs的形成是比較復(fù)雜的過程，溫度的降低是形成AFPs的主要因素。溫度控制抗凍基因的表達，AFPs與植物的抗性密切聯(lián)系。相對于動物蛋白而言，的研究植物AFPs的研究起步較晚，雖然已被研究的植物材料達40余種，但真正被分離并被轉(zhuǎn)基因功能驗證的AFPs并不多。目前，主要對以下植物的AFPs進行了研究：冬黑麥、千年不爛心、沙冬青、無頭甘藍、胡蘿、桃樹、冬小麥、黑麥草、唐古紅景天、珠芽蓼[31-33]。在小麥族中抗凍蛋白被稱為重結(jié)晶抑制蛋白（IceRecrystallisationInhibition，IRI）或IAPs(Ice-activeproteins)。Sandve[34]從黑麥草和大麥中分離了15個IRI蛋白基因，并與水稻、擬南芥等相應(yīng)同源基因進行了分子進化分析。Krishnanand[15]從黑麥草中分離了5個IAPs基因，比較結(jié)果表明其均具有IRI類似基因的典型結(jié)構(gòu)特征，同時存在一定的差異。對其中3個基因進行體外表達和功能分析發(fā)現(xiàn)，IAPs均具有抑制重結(jié)晶的活性。Tremblay[36]等從冬小麥中分離了2個IRI蛋白基因TaIRI1和TaIRI2，并對兩個基因進行了體外表達分析，但對于IRI蛋白基因的功能分析及遺傳轉(zhuǎn)化未做詳細(xì)研究，限制了對IRI基因功能和表達調(diào)控機制的全面了解。
本研究以小麥野生近緣屬種尾狀山羊草、彭梯卡侖麥草、支藥大麥草、布頓大麥草、沙生冰草為研究材料，對小麥野生近緣屬種IRI基因基因進行分離和鑒定，克隆其編碼區(qū)，并對所克隆IRI基因進行進化分析，即小麥野生近緣屬種IRI基因之間彼此在堿基
7小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
排列、氨基酸、重復(fù)區(qū)的等的共同性與差異性。這些將為闡明小麥低溫脅迫過程中IRI基因表達調(diào)控機理以及更詳盡的揭示小麥抗寒分子機制提供重要參考，同時為發(fā)掘新型抗寒基因和通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高小麥的抗寒力奠定理論基礎(chǔ)。
8沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
2.材料、試劑
2.1材料及處理
供試材料：尾狀山羊草、彭梯卡侖麥草、支藥大麥草、布頓大麥草、沙生冰草等小麥近緣屬種編號為B1-B25(25個品種)、W1-W15（15個品種）201*系列（201*-1,201*-4,201*-7三個品種）、PI（37個品種）和W6（8個品種）系列開頭。在90個品種中，種質(zhì)資源B1-B25、W1-W15和201*系列來源于中國農(nóng)科院、PI和W6由美國種子資源中心提供。
材料處理：挑選籽粒飽滿的小麥野生近緣屬種材料種子，將其表面用75%的酒精消毒，然后將種子放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，保持種子充分濕潤。待幼苗生長7-14d左右種子長出幼苗后，選取綠色嫩葉進行DNA提取。
2.2菌株與載體
試驗所用大腸桿菌菌株E.coliTop10購于天根生化科技（北京）有限公司。質(zhì)粒載體pGM-T購自TaKaRa公司。
2.3酶與試劑
新型植物基因組DNA提取試劑盒、DL201*DNAmarker、T4DNA連接酶、pGM-T載、Taq酶購于天根生化科技（北京）有限公司，IPTG，X-Gal，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于XYGEN公司，引物由賽百盛公司合成，測序由北京天根公司、上海生工完成；其余試劑為國產(chǎn)分析純，取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)國資處，低熔點瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品。
液氮純度為99.999，由沈陽特種氣體廠提供。
實驗所用引物：
IRI-F：5-ATGGCGAAATGC(G/T)GGCTG-3IRI-F新：5-ATGGCGCC(A/G)AAATGCTGGCT-3
IRI-R1：5-ATTGTGAGCTACACTGAACTTGGACA-3IRI-R2：5-TCATTCATCTCCTACGACTTTGTT-3IRI22-R：5-CCAAGCTTTCATTCATCTCCTGTT-3IRIR1新：5-GATTGTGAGCTACACTGAACTTGG-3IRIR2新：5-TCATTCATCTCCTACGACTTTGTT-3IRIR3新：5-TTAACCTCC(T/C)GTCACGACTTTGTT-3
9小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
其中引物組合為：IRI-F和IRI-R1、IRI-F和IRI-R2、IRI-F和IRI22-R、IRI-F和IRIR1新、IRI-F和IRIR2新、IRI-F和IRIR3新；IRI-F新和IRIR1新、IRI-F新和IRIR2、IRI-F新和IRIR3新。
由于要克隆的IRI基因多樣性，在根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的IRI基因數(shù)據(jù)，用primer設(shè)計引物克隆小麥近緣屬種中IRI基因時，發(fā)現(xiàn)即使在同源區(qū)段也存在一個或多個堿基的不同，所以設(shè)計了兼并引物的同時也設(shè)計了多對引物。本課題研究的是克隆多個與小麥親緣關(guān)系較近的植物屬種的IRI基因，數(shù)據(jù)量以及信息較多，所以利用多對引物對實驗材料進行廣泛的IRI基因篩選。
2.4實驗相關(guān)儀器及生物軟件
主要儀器：BIO-RADPTC-200型PCR儀；BIO-RAD凝膠成像儀；DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；超純水儀(PALLPL5243)；HERMLEZ233MK-2臺式微量冷凍離心機；HITACHISCR20BA高速冷凍離心機；HH-6恒溫水浴鍋；MP200A分析天平；Eppendorf移液器2.5ul、10ul、100ul、1000ul；超凈工作臺。
相關(guān)生物學(xué)軟件及網(wǎng)站：引物設(shè)計軟件Primer5.0，序列分析軟件DNAMAN，MEGA3.0，NCBIBlast：。
2.5相關(guān)試劑的配制
液體LB培養(yǎng)基（1L）：
細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10.0g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5.0gNaCl10.0g
固體LB培養(yǎng)基（1L）：
細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10.0g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5.0gNaCl10.0g瓊脂15.0g
在950mL去離子水中加入以上各溶質(zhì)，充分?jǐn)嚢枞芙�，滴�?molL-1NaOH（約0.2mL）調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L（固體培養(yǎng)基每L加15g瓊脂粉），121℃高壓蒸汽滅菌20min。
100mgmL-1氨芐青霉素（Amp）貯液：稱取100mgAmp溶于1mLddH2O中，
10沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
用0.22m濾器過濾除菌，-20℃保存。
0.1molmL-1IPTG（異丙基硫代β-D-半乳糖苷）：稱取2gIPTG溶于8mLddH2O中，充分混合溶解后定容至10mL，用0.22m濾膜過濾除菌，每份1mL，-20℃保存。
20mgmL-1X-Gal（5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷）：稱取1gX-Gal置于50mL離心管中，加入40mLDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后定容至50mL，每份1mL，-20℃避光保存。
10gmL-1EB溶液（溴乙錠）：1mg溴乙錠加入100mL去離子水中，充分溶解后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫避光保存。工作時稀釋到0.5gmL-1。
10×TBEBuffer（pH8.3）：Tris108gNa2EDTA2H2O7.44g硼酸55g定容至1000mL，室溫保存。
上樣緩沖液（6×）：稱取溴酚藍250mg，加重蒸水10mL，室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖40g，加重蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，混勻后加重蒸水定容至100ml。
11小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
3.實驗方法與步驟
3.1植物基因組DNA的提�。ㄖ参锘蚪MDNA提取試劑盒）
1）取植物新鮮組織100mg或干重20mg，加液氮充分研磨。用小勺取適當(dāng)研磨碎屑于1.5ml或2.0ml離心管中，離心管中已加入400ml緩沖液LP1和6LRNaseA（10mg/L），漩渦震蕩1min靜置10min（室溫）。
2）加入130ml緩沖液LP2，充分混勻，漩渦震蕩1min。3）1201*r/min離心5min，將上清液移至新離心管。
4）加入1.5倍體積緩沖液LP3立即充分混勻15s，可能會有絮狀沉淀。
5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），1201*r/min離心30s，倒廢液，吸附柱CB3放入收集管中。注：因步驟4中總體積=750+500=1250L，而吸附柱最大容積為700L。故步驟5分為兩小步：（1）.先吸取700L液加入到吸附柱CB3，1201*r/min離心30s，倒廢液。（2）.再吸剩余550L液加入到吸附柱CB3重復(fù)一次。
6）向吸附柱CB3中加700ml漂洗液PW（使用前檢查是否已加入無水乙醇），1201*r/min離心30s。倒廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。注：若吸附柱膜呈綠色，向吸附柱CB3中加500L無水乙醇，1201*r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。7）向吸附柱CB3中加入500L漂洗液PW，1201*r/min離心30s，倒掉廢液。
8）將吸附柱CB3放回收集管中，1201*r/min離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3放置室溫數(shù)分鐘（5-6min）以徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液。注：這一步目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液，漂洗液中乙醇的殘余會影響后續(xù)酶反應(yīng)實驗。
9）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50-200L洗脫緩沖液TE，室溫靜置2-5min，1201*r/min離心2min，將溶液收集到離心管中。注：為增加基因組DNA得率，可將離心溶液再加入吸附柱CB3中室溫靜置2min。
3.2IRI基因的PCR擴增
PCR體系：下述溶液、試劑按順序添加
ddH201*.6l
10×TaqPCR緩沖液2.5ldNTPs0.4l引物F1.0l引物R1.0l
12沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
模板DNA2l
Taq酶（Tiangen）0.5l注：引物F指代IRI-F、IRI-F新
引物R指代IRI-R1、IRI-R2、IRI22-R、IRIR1新、IRIR2新、IRIR3新
總體積：25l。
PCR程序：
94°C5min
94°C30s50-60°C45s72°C1min72°C7min16°C10min
將PCR程序擴增后的PCR產(chǎn)物與溴酚藍或6*loadingbuffer或10*loadingbuffer上樣緩沖液混勻，點入電泳槽的瓊脂糖凝膠孔槽中。
注：退火溫度為50-60°C表示由于引物組合不同，PCR反應(yīng)最適合的退貨溫度不同。實驗中所用的引物對應(yīng)PCR的最適合溫度采用的是梯度PCR篩選的，即退貨溫度50-60°C進行篩選的。
35個循環(huán)
3.3目的片段與載體連接
連接體系（連接試劑盒由天根生化科技公司提供）
目的PCR片段7lPGM-T載體1l連接酶緩沖液1lT4DNA連接酶1l反應(yīng)體系總體積：10l
上述溶液按順序分別加入200l的PCR管中后，混合液輕輕震蕩后順勢離心，置于16℃鏈接反應(yīng)10-12h。連接后的產(chǎn)物直接用來轉(zhuǎn)化或者置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫ㄟB接產(chǎn)物不穩(wěn)定，連接過后產(chǎn)物所處的溫度越高連接的效果降低越快，若保存2-3天需置于-20℃冰箱）。
13小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
3.4轉(zhuǎn)化
1）將恒溫水浴鍋溫度調(diào)至42℃。
2）取5l重組DNA混合液加入100l感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕震蕩后置于冰上30min。3）輕輕搖勻后放置冰上，42℃水浴鍋中熱擊90S，然后迅速放回冰中，靜置3-5min。4）在超凈工作臺上向管中加入500l預(yù)熱至37℃的LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），輕輕混勻然后固定到搖床的彈簧架上，37℃低速震蕩1h。
5）將含50mlLB固體培養(yǎng)基放入微波爐熔化后放置于超凈工作臺，待LB固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右（不燙手時）時加入25l100mg/ml的Amp，混勻后分裝于2個平板培養(yǎng)皿中。待LB固體培養(yǎng)基室溫冷卻凝固后再用。
6）取出步驟4）中菌液，5000-7000轉(zhuǎn)離心5min，用移液器吸掉200l上清液，把離心管中剩余的上清液和離心管底部菌液混勻。
7）在超凈工作臺上取上述轉(zhuǎn)化的菌液100-300l，滴到LB平板培養(yǎng)皿（含50g/ml的Amp）中，再在平板上滴加40l20mg/ml的x-gal，10l0.1mol/l的IPTG，用燒過的玻璃棒冷卻后涂布均勻。
8）在涂好的培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，先正放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30min，待培養(yǎng)基表面的液體都滲入培養(yǎng)基后，倒置培養(yǎng)皿，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜（12-16h），出現(xiàn)菌落。
3.5陽性克隆：藍白斑篩選
經(jīng)過過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)板上生長出藍白斑，藍斑為T載體自身連接形成的空質(zhì)粒，白斑為目的基因與T載體連接形成的環(huán)形質(zhì)粒。篩選出白斑，用消過毒的牙簽或接種針挑取單個菌落，于平板LB固體培養(yǎng)基上劃線，過夜培養(yǎng)（12-16h）。
3.6菌落PCR
ddH201*.6l
10×TaqPCR緩沖液2.5ldNTPs0.4l引物F1.0l引物R1.0l
模板DNA2l
Taq酶（Tiangen）0.5l程序同之前的PCR一樣。
14沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
3.7搖菌測序
1)取1.5ml離心管，加入1mlLB液體培養(yǎng)基，再加入1l100mg/ml的Amp并編號。2）選取之前菌落PCR出現(xiàn)目的片段的單菌落，用滅過菌的牙簽或槍頭挑菌到LB液體培養(yǎng)基的離心管中，混勻。封蓋，并用封口膜封住離心管蓋邊緣防止雜菌污染。3）置于37℃水浴或空氣浴搖床，180r/min過夜培養(yǎng)12-16小時。4）送至測序公司測序。
4．實驗結(jié)果與分析
4.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測
201*bp1000bp750bp500bp250bp100bpB15B19B25圖4.1
B2marker
根據(jù)primer引物設(shè)計軟件設(shè)計的引物，對小麥近緣屬種進行IRI克隆的片段的大小應(yīng)該在700-1000bp左右。圖中的B2為單一的亮帶，而B25、B19、B15出現(xiàn)了多條帶，主要由于IRI基因是一個多基因家族，所以在用PCR過程中，同一對引物的PCR可能同時兩條或多個片段在700-1000bp的條帶，由于對這些條帶的序列未知，所以這些片段都進行回收做后續(xù)連接、轉(zhuǎn)化、測序，以確定是否為IRI基因。圖中還出出現(xiàn)了在700-1000bp外出現(xiàn)了其它片段和同一品種間條帶亮度不一（如B25三個孔槽中只有退火溫度不同，導(dǎo)致了條帶亮度不同），這樣的原因是由于實驗所用的引物為通用引物，而
15小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
且PCR程序在篩選最適的退火溫度中用了梯度溫度。圖中700-1000bp有條帶而且清晰，確保了可以做切膠回收，做后續(xù)步驟。
4.2測序結(jié)果及分析
表4.1
通過用9對引物（IRI-F和IRI-R1、IRI-F和IRI-R2、IRI-F和IRI22-R、IRI-F和IRIR1新、IRI-F和IRIR2新、IRI-F和IRIR3新；IRI-F新和IRIR1新、IRI-F新和IRIR2、IRI-F新和IRIR3新），對小麥野生近緣屬種編號為B1-B25、W1-W15、W1-W15（15個品種）、Pi和W6系列進行IRI基因克隆。
在供試材料90個品種中，許多小麥野生近緣屬種的植物種子萌發(fā)過程實驗中從未發(fā)芽，沒有綠葉。其次在種子萌發(fā)成幼苗的品種提取DNA后進行IRI基因的PCR擴增,許多也出現(xiàn)沒有擴增條帶，或者是擴增出的條帶不在預(yù)計700-1000bp范圍內(nèi)。最終能通過PCR得到700-1000bp片段的品種列舉在表4.1中。
表4.1列舉了所用引物組合的PCR反應(yīng)能擴增出700-1000bp左右的片段。在擴增的片段中，有的能擴增出一條在700-1000bp條帶，而有的能在700-1000bp間擴增出多條片段，如W22-W25能擴增4條片段。通過測序發(fā)現(xiàn)，即使PCR過程中我們能用引物擴增出預(yù)計IRI基因額大小片段，但是許多的測序結(jié)果不是，只有少數(shù)PCR擴增產(chǎn)物在后續(xù)產(chǎn)物中測序后進行分析發(fā)現(xiàn)與IRI基因相似性高（B2、B13、B15、B19、B25、W5、
16沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
201*-1、W6-19191）。
分析上述結(jié)果，有以下幾點原因：(1)重結(jié)晶抑制蛋白IRI基因是一個多基因家族，即使是同一個品種也會有多個IRI基因；（2）由于設(shè)計的引物是兼并引物，在PCR過程中與目的DNA的結(jié)合性不緊密而結(jié)合到別的片段上，擴增出片段，而這些擴增的片段可能在我們正需要的700-1000bp之間，也可能不在；（3）多對引物組合，不同的引物組合得到進行PCR擴增，得到不同的結(jié)果。
4.3測序結(jié)果的DNA多序列比多和氨基酸序列比對分析
經(jīng)過NCBIBlast：網(wǎng)站對測序結(jié)果的基因比對，去除掉與IRI相似性極低的序列，最終篩選出編號為B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21共8個序列可以使用。這些獲得的IRI基因編號對應(yīng)的植物品種分別為：B2-沙生冰草、B15-簇生麥草、B24-布頓大麥草、B25-支藥大麥草、W15-單芒山羊草、W17-高大山羊草、W21-擬斯卑爾脫山羊草。
17小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
B2a.seqB2b.seqB15c.seqB24.seqB25.seqW15.seqW17.seqW21.seqATGGCGCCGAAATGCTGGCTGCTGCTCCACTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCGGCGGCGAGCGCTACGTCGTGCCATGCTGACGACCTCCACGCGCTGCAGGGCTTCGCCGGGAATCTCAGT...........ATGCGGGCTGCTACTCCTGTTCT.GGCGTTCCTCTTGCCTGTGGCAAGCGCGACGTCATGTCACGCTGATGACCTCCATGAGCTGCGGGGCTTCGCTGGGAAGCTCACA...ATGGCGAAATGCGGGCTGCTGCTCCACTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCGGCGGCGAGCGCTACGTCGTGCCATGCTGACGACCTCCTCGCGCTGCAGGGCTTCGCCGGGAATCTTAGTATGGCGCCAAAATGCTGGCTGATGCTCCTCTTCTTGGTGTTTCTCCTGCCGGCGACGAGCGCGAGGTCGTGCCACGCCGACGACCTCCGTGCACTGCGGGACTTCGCCCGGAACCTCACT...ATGGCGAAATGCTGGCTGCTGCTCCTGTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCAGCGGCACGTGCAACGTCATGCCACCCCGATGACCTCCGCGCGCTACGGGGCTCTGCCGGGAACCTTAGT...ATGGCGAAATGCTGGCTGGTGCTCCTCTGCTTGGTGTTCCTCCTGCTGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCTGCACTCTGCGGGACTTTGCCCGGAACCTCACC...ATGGCGAAATGCGGGCTGGTGCTCCTCTGCTTGGTGTTCCTCCTGCTGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCTGCACTCTGCGGGACTTTGCCCGGAACCTCACC...............GGGCTGATGCTCCTCTTCTTGGTGTTTCTCCTGCCGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCCACGCACTGCGGGAATTCGCCCGGAACCTCACC11111111B2a.seqB2b.seqB15c.seqB24.seqB25.seqGGTGGCGGCGTGCTCCTACGCGCTGTGTGGTCCGGCGCCTCGTGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGAGCTGCGACAGCACAAGTGGACGCGTCACGGCGCTTTGGCTCACCGGGCGCAGCCTTGGCGGTGGCGTGCTTCTCCGCGCCGCGTGGTCTGGCACTTCATGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGGGTTGTGACGGCGCAAGTGGACGGGTCACCGTGTTGCGGCTCCCAGGGTGCGGCCTTGGTGGCGGCGTGCTCCTACGCGATGTGTGGTCCGGCGCCTCGTGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGAGCTGCGACGGCACAAGTGGACGCGTCACGGTGCTTTGGCTCCCCGGGCGCAGCCTTGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGGACATCGTGTTGCAGATGGGAAGGTGTGGGCTGCAACGGCGCAAGTGGACGCGTCACAACGCTGCGGCTTCCCGGCCGCGGCCTTGGTAGGGCTGTCCTCCTCCGTGCTGCGTGGTCCGATGCCTCGTGCTGAGGCTGGGAAGGTGTGGGCTGCCATCGTGCTAGTGGCCGCGTCACGTCCCTGCGGCTCCCTGGACACGGCCTT22222W15.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGAACCACGTGTTGTGGCTGGGAAGGTGTGAACTGCGACGGCGTAAGTGGACGCGTCACGGCGCTGCGGCTCCCCGGGCGCGGCCTTW17.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGAACCACGTGTTGTGGCTGGGAAGGTGTGAACTGCGACGGCGTAAGTGGACGCGTCACGGCGCTGCGGCTCCCCGGGCGCGGCCTTW21.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGCGCAGCGTGGTCCGGCACCTGGTGTTGCAGATGGGAAGGTGTGGGCTGCGACGGCGGAAGTGGACGCGTCACAACGCTGCGGCTTCCCGGACGCGGCCTTB2a.seqGCGGGGCCCATCCCAGGAGCTTCCTTGGTGGGCCTCACGCAACTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAAACTAATCGGCAACATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCB2b.seqACTGGACCCATCCCAGGAGCATCCTTTGCGGGCCTGGTGCAGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAGCAACAGATTGGTCAGCACCATCCCTTTGTGGATCGGTGAGCTTCAACACCTTTGCB15c.seqGCGGGGCCCATCCCAGGAGCCTCCTTGGTGGGCCTCACGCAACTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAAACTAATCGGCAACATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCB24.seqGCAGGACCCATCGCAGGAGCATCCTTGGCGGGCTTAGCGTGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGGCTGATCGGCACAATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTB25.seqGCGGGGGCCATCCCAAGAGCATCCTTGGCAGGCCTCGCACGGTTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGGTTGGCACCATCCCATCGTGGATTGGCCAGCTTGATCACCTTTGCW15.seqGCAGGACCCATTGCAGGAGCATCCTTGGCAGGCCTGGCATGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACCATTCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGACCACCTTCGTW17.seqGCAGGACCCATTGCAGGAGCATCCTTGGCAGGCCTGGCATGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACCATTCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGACCACCTTCGTW21.seqGCAGGACCCATCGCTGGAGCATCCTTGGCGGGCTTGGCGCGGCTAGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACATTCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTB2a.seqTACTTGGATCTCTCCGATAATTCATTGGAAGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACGGCTTAAGGGTCTCGTTGCTGCTGGACGTTCAGTGGGTATGACATTCACTAACATGCCATTGTATB2b.seqTACTTGGATCTCTCTGATAATCCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCAGCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCGTTCACTAATATGCCATCGTATB15c.seqTACTTGGATCTCTCCGATAATTCATTGGAAGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACGGCTTAAGGGTCTCATTGCTGCTGGTCGTTCAGTGGGTATGACATTCACTAACATGCCATTGTATB24.seqTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTGATACGGTTCAAGGACATCACCAGCGCTGGTCGCTCATTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATB25.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACAGCTCAAGGGCCTAGTCATCGCTGGTCCTTCATCGGGTATGACTTTTACTAGCATGCCTTTGTATW15.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCGCCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATW17.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCGCCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATW21.seqTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTGATACGGTTCAAGGACATCACCATCGCTGGTCGCTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTATATB2a.seqGAGAAGCATAACCGAAGAACACTCCAAC...AACAACAACCAAATATCATATCCGGGACAAACAACAAAGTCAGATCTGGTAGAACCAATGTTGTATCTGGAAATGACAACACGGTCAAAB2b.seqGTGAAGCGTAACAGAAGAACACTCCAGG...AACAACAACCAAACACAATATCTGGGACCAACAATACTGTCAGATCTGGGAGAAACAATGTTGTTGCCGGGAACGACAACACTGTCATAB15c.seqGTGAAGCGTAACCGAAGAACACTCCAAC...AACAACAACCAAGTATCATATCCGGGACAAACAACAAAGTCAGATCTGGTAGAACCAATGTTGTATCTGGAAATGACAACACGGTCATAB24.seqGTGAAGCGTAACAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACGATATCTGGGACCAACAATAGCGTCAGATCTGGGAGAACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAB25.seqGGGAAGCGTAACAAAAGAACGCTTGACG......AACAACCAAATACAATATCTGGGAGTAACAACACCGTCAAATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAATACTGTCATAW15.seqGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCCACCAAATACGATATCAGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTAGGAATGACAACACTGTCATAW17.seqGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACGATATCAGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAW21.seqGTGAAGAGTAACAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACAATATCTGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAB2a.seqTCTGGAAACAACAACACTGTGGCTGGGAGCAACAATACCATCACAACTGGGAGCGACAATACCGTAGTAGGTAGCAACCATGTCGTATCTGGGACCAAACATATCGTAACTGACAACAACB2b.seqTCCGGCGACAACAACAATGTGTCTGGGAGCAACAACACTATCGTAACGGGGAGCGACAATACCGTAGTTGGTAGCAACCATGTTGTATCTGGGAACAAACATGTCGTAACTGACAACAACB15c.seqTCTGGAAACAACAACACTGTGGCTGGGAGCAACAATACCATCACAACTGGGAGCGACAATACCGTAGTAGGTAGCAACCATGTCGTATCTAGGACCAAACATATCGTAACTGACAACAACB24.seqTCCGGGGACAACAACAATGTGTCCGGGAGTAACAACACTATCGTTACCGGTAGCGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAACATGTTGTAACTGACAACAACB25.seqTCCGGGAACTACAACAATGTGGCTGGGAGCAACAACACTATCGTAACCGGGAGCGATAATACTGTAACTGGTAGCAACCATGTCGTATCTGGGGACAAACATATCGTAACTGACAACAACW15.seqTCTGGTAACAACAACAGTGTGTCAGGGAGTAACAACACTATCATAACCGTTAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCA.CCATGTCGTATCTGGGAACAAGCATGTCATAACTGACAACAACW17.seqTCTGGGAACAACAACAGTGTGTCAGGGAGTAACAACACTATCATAACCGGGAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAGCATGTCATAACTGACAACAACW21.seqTCCGGGAACAACAACAATGTGTCCGGGAGTAACAACACTATCGTAACCGGTAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAACATGTCGTAACTGACAACAACB2a.seqAATGTTGTTTCCGGGATTGACAATAATGTATCCGGCAGCTTCCACACCGTATCCGGGAGTCACAATACCATATCCGGGAGCAACAATACCGTATCAGGGAGCAACCATATTGTGTCTGGGB2b.seqAATGTCGTATCCGGAGACGACAATACTGTATCCGGGAGCTTCCATACCGTATCTGGGAGCCACAACACCGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGGACCAACCATGTCGTCTCTGGGB15c.seqAATGTTGTTTTCGGGATTGACAATAATGTATCCGGCAGCTTCCACACCGTATCCGGGAGTCACAATACCATATCCGGGAGCAACAATACCGTATCAGGGAGCAACCATATTGTGTCTGGGB24.seqAATGCCGTATCCGGAAATGACAATAATGTATCCGGGAGTTTCCATACCGTATCCGGGAGCCGCAT.ACTGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCACGTCGTGTCTGG.B25.seqAATGTCGTATCCGGAAATGACAATAATGTATCCGGAAGCTTCCATACCGTATCCGAGAGCAAGAATATTGTATCTGGGAGCAACAACACTGTATCTGGGAGCAACCATGTTGTATCCGGGW15.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCTGG.AGCTTCCATACGGTATCCGGGAGCCTCAATACA.TATCTGGGAGCAACAT.ACCGTATCTGGCAGCAT.CATGTCGTGTCTGGGW17.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCCGGGAGCTTCCATACGGTATCCGGGAGCCGCAATACAGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCATGTCGTGTCTGGGW21.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCCGGGAGCTTCCATACCGTATCCGGGAGCCGCAATACTGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCACGTCGTGTCTGGGB2a.seqAGCAACAAAGTCGTGACGGGAGGTTAA...B2b.seqAGCAACAAAGTCG...TAGGAGATGAATGAB15c.seqAAGCAACAAGTCGTGACGGGAAGTTAA...B24.seqAGCAACAAAGTCGTAACAG.AGATGAATGAB25.seqAGCAACAAAGTCG...TAGGACATGCATGAW15.seqAGCAACAAAGTCG.AACAG.AAATGAATGAW17.seqAGCAACAAAGTCGTAACAGGAGATGAATGAW21.seqAGCAACAAAGTCGTAACAGGAGATGAATGA圖4.2DNA序列比對圖（B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21）
在獲得并分析的IRI基因中，DNA序列最短的為849bp，最長為864bp，片段在
18222333333334444444455565555777777778888888888888888
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
700-1000bp區(qū)間內(nèi)，其中B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25編碼的氨基酸總數(shù)分別為287、283、286、288、284、285、288、284。圖4.2中為所獲得并能分析的IRI基因，圖中藍黑色背景的堿基為8基因完全共有的區(qū)段片段，我們可以清晰到看到這些IRI的DNA片段共有區(qū)段多，相似性高；白色背景中的黑點表示在DNA序列比對中，此處不具有共有的堿基，其它背景顏色表示部分DNA共有堿基。
B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQMAPKCWLLLHFLAFLLPAASATSCHADDLHALQGFAGNLSGGGVLLRAVWSGASCCGWEG....MRAATPVLAFLLPVASATSCHADDLHELRGFAGKLTGGGVLLRAAWSGTSCCGWEG.MAKCGLLLHFLAFLLPAASATSCHADDLLALQGFAGNLSGGGVLLRDVWSGASCCGWEGMAPKCWLMLLFLVFLLPATSARSCHADDLRALRDFARNLTGGGVILRAAWSGTSCCRWEG.MAKCWLLLLFLAFLLPAARATSCHPDDLRALRGSAGNLSGRAVLLRAAWS.DASCGWEG.MAKCWLVLLCLVFLLLATSATSCHADDLCTLRDFARNLTGGGVILRAAWSGTTCCGWEG.MAKCGLVLLCLVFLLLATSATSCHADDLCTLRDFARNLTGGGVILRAAWSGTTCCGWEG.....GLMLLFLVFLLPATSATSCHADDLHALREFARNLTGGGVILRAAWSGTWCCRWEG6056596058595955B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQVSCDSTSGRVTALWLTGRSLAGPIPGASLVGLTQLEELNLANNKLIGNIPSWIGELDHLCVGCDGASGRVTVLRLPGCGLTGPIPGASFAGLVQLEELNLASNRLVSTIPLWIGELQHLCVSCDGTSGRVTVLWLPGRSLAGPIPGASLVGLTQLEELNLANNKLIGNIPSWIGELDHLCVGCNGASGRVTTLRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELEHLRVGCHRASGRVTSLRLPGHGLAGAIPRASLAGLARLEELNLANNRLVGTIPSWIGQLDHLCVNCDGVSGRVTALRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELDHLRVNCDGVSGRVTALRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELDHLRVGCDGGSGRVTTLRLPGRGLAGPIAGASLAGLARLEELNLANNRLIGTFPSWIGELEHLR1201*61191201*8119119115B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQYLDLSDNSLEGEVPKSLLRLKGLVAAGRSVGMTFTNMPLYEKHNRRTLQQQQ.PNIISGTYLDLSDNPLIGEVPKSLIRFKGISIAGRSLGKAFTNMPSYVKRNRRTLQEQQ.PNTISGTYLDLSDNSLEGEVPKSLLRLKGLIAAGRSVGMTFTNMPLYVKRNRRTLQQQQ.PSIISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKDITSAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPQPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLLQLKGLVIAGPSSGMTFTSMPLYGKRNKRTLDEQ..PNTISGSYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKGIAIAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPPPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKGIAIAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPQPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKDITIAGRSLGKAFTNMPLYVKSNRRTLQQQPQPNTISGT179175178180176179179175B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.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.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQNVVSGIDNNVSGSFHTVSGSHNTISGSNNTVSGSNHIVSGSNKVVTGG.NVVSGDDNTVSGSFHTVSGSHNTVSGSNNTVSGTNHVVSGSNKVVGDE.NVVFGIDNNVSGSFHTVSGSHNTISGSNNTVSGSNHIVSGKQQVVTGS.NAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRILYLGATIPYLEATTSCLEQQSRNRDE.NVVSGNDNNVSGSFHTVSESKNIVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVGHA.PYPETTIMYLELPYGIREPQYIS..GSNIPYLAASCRVWEQQSRTEMN.NAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRNTVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVTGDENAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRNTVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVTGDE287283286288284285288284
圖4.3氨基酸序列比對圖（B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21），圖中下劃線表示信號肽，向上的箭頭表示半胱氨酸殘基，水平向右的箭頭表示LRR（亮氨酸酸富集區(qū)），水平雙
向箭頭代表NxVxxG/NxVxxG區(qū)。
19小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
由于DNA的序列比對只能說明基因在堿基上相似性等相關(guān)問題，而基因的功能是通過蛋白表達表現(xiàn)出來的，而且在DNA序列中，經(jīng)常會出現(xiàn)堿基的插入或者缺失導(dǎo)致移碼突變，或者由于堿基突變但不一定引起氨基酸的改變等現(xiàn)象，所以我們我們將DNA翻譯成氨基酸，從氨基酸層面上對所獲得8個基因進行分析，同時結(jié)合DNA序列和氨基酸序列進行分析。
圖4.3氨基酸比對圖中，橫線下劃線處為8個IRI基因氨基酸的信號肽區(qū)域，從圖中可以看出8個IRI基因氨基酸的的信號肽并非完全相同，只是部分的氨基酸相同。真核細(xì)胞N末端的信號肽位，一般由15～30個氨基酸組成。包括三個區(qū)：一個帶正電信號肽的N末端，稱為堿性氨基末端：一個中間疏水序列．以中性氨基酸為主，能夠形成一段d螺旋結(jié)構(gòu)，它是信號肽的主要功能區(qū)；一個較長的帶負(fù)電荷的C末端，含小分子氨基酸，是信號序列切割位點，也稱加工區(qū)。當(dāng)信號肽序列合成后，被信號識別顆粒(SRP)所識別，蛋白質(zhì)合成暫�；驕p緩，信號識別顆粒將核糖體攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，蛋白質(zhì)合成重新開始。在信號肽的引導(dǎo)下，新合成的蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔．而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除，這些信號肽的不同將引起其表達過程中的差異。
半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)折疊過程中起著重要作用。偶數(shù)的半胱氨酸殘基可以兩兩形成二硫鍵，二硫鍵能使蛋白折疊更加緊密，而奇數(shù)的半胱氨酸殘基則會多出一個半胱氨酸殘基，對蛋白折疊牢固產(chǎn)生影響[37]。除了編號為B25基因的氨基酸有三個半胱氨酸殘基外，其余的7個IRI基因均有四個半胱氨酸殘基（圖4.3）,該半胱氨酸的改變可能B25植物的抗寒能力，但是需要要后續(xù)的實驗研究進行驗證。
和其它已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的重結(jié)晶抑制蛋白一樣，我們在我們所獲得的8個基因中也含有亮氨酸富集區(qū)（LLR）。圖4.3中水平右向箭頭起向右區(qū)域可以清晰看到多個L的重復(fù)。
圖4.1中可以看到在DNA序列比對上W15和B24的C末端和其它6個基因的相似性和重復(fù)性非常高，而在圖4.2中在紅色矩形框內(nèi)，發(fā)現(xiàn)W15和B24編碼的氨基酸序列和其它6個基因基本上沒有相似性，這樣的原因可能是由于堿基插入或缺失造成，導(dǎo)致移碼突變，后續(xù)氨基酸的編碼全部錯位，這種結(jié)構(gòu)變化可能導(dǎo)致整個IRI蛋白的失活，或者功能降低。
4.4IRI的進化分析
本研究將所獲得的IRI基因和從NCBI搜索的多個小麥野生近緣植物IRI基因匯總在一起，進行系統(tǒng)進化分析。圖4.4和圖4.5是基因進化分析的兩種不同表現(xiàn)形式，圖4.4無根樹形式可以直觀的看到基因的分類和親緣關(guān)系的遠近，而圖4.5有根樹親緣關(guān)系的遠近更形象的展示出來。其中如圖4.4中可以大致分為六個部分:EU887261.1,AK360260.1,B25,AY968588.1;AK360446.1;FJ663038.1和EU680848.1;B2a和B15c;B2b;
20沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
AK360446.1;W17。
由分子進化樹可以看出，AK360260.1（大麥草）、EU887261.1（大麥草）和B25（支藥大麥草）親緣關(guān)系最近；B2A（沙生冰草）和B15（簇生麥草）親緣關(guān)系最近；B2B（沙生冰草）與其它物種的情緣關(guān)系較遠；B24（布頓大麥草）和W21（擬斯卑爾脫山羊草），W15（單芒山羊草）與W17（高大山羊草）在IRI基因分類上較近。
對于從同一材料中克隆出的IRI基因（B2a和B2b來自同一植物）親緣關(guān)系應(yīng)該是最近的，但B2a和B15c親緣關(guān)系比B2a和B2b更近，說明IRI基因家族存在較為豐富的變異，推測可能是在植物長期進化過程中不斷適應(yīng)低溫變化而調(diào)整自身基因結(jié)構(gòu)從而適應(yīng)低溫環(huán)境的原因。
AK360260.1Translation.seqEU887261.1Translation.seqB25Translation.seqAY968588.1Translation.seqAK360446.1Translation.seqEU680848.1Translation.seqFJ663038.1Translation.seqB2aTranslation.seqB15cTranslation.seqB2bTranslation.seqB24Translation.seqW21Translation.seqW15Translation.seqW17Translation.seq0.05
圖4.4IRI基因進化分析-有根樹
21小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
AK360446.1Translation.seqFJ663038.1Translation.seqEU680848.1Translation.seqAY968588.1Translation.seqB2aTranslation.seqB15cTranslation.seqB25Translation.seqEU887261.1Translation.seqAK360260.1Translation.seqB2bTranslation.seqW17Translation.seqW21Translation.seqB24Translation.seqW15Translation.seq0.05圖4.5IRI基因進化分析-無根樹
22沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
5．討論
本文利用同源克隆的思維方法，根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中已有的IRI序列的信息，設(shè)計簡并引物對小麥野生近緣屬種IRI基因進行分離，以分析不同小麥族材料間IRI基因的結(jié)構(gòu)變化和系統(tǒng)進化關(guān)系。從最初的9對引物對90個小麥野生近緣材料的IRI基因進行擴增，最終我們得到了編號為B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25的8個IRI基因，而8個基因分屬7個材料（其中B2A和B2B來源于同意材料）。
在進行PCR的過程中，對90個植物品種中我們用了多對引物組合進行擴增，同時還分別運用了梯度PCR進行篩選最適的引物退火溫度、小套大的嵌套PCR和降落PCR（TouchdownPCR）去除非特異擴增。TouchdownPCR是指每隔一個循環(huán)降低1°C反應(yīng)退火溫度，直至達到—Touchdown‖退火溫度，然后以此退火溫度進行10個左右的循環(huán)。該方法最初出現(xiàn)是為了避開確定最佳退火溫度而進行的復(fù)雜的反應(yīng)優(yōu)化過程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量的兩倍差異（每攝氏度造成4倍差異）。因此相對于非正確產(chǎn)物，正確的產(chǎn)物可以得到富集該方法。即便使用了多種PCR方法，在PCR產(chǎn)物凝膠電泳中我們依然發(fā)現(xiàn)了有多個條帶在700-1000bp。
實驗中中得到的B2A和B2B說明了我們進行克隆的IRI基因并不只以單基因形式存在，而是多基因家族。B2A、B2B編碼的氨基酸總數(shù)分別為287、283，在長度上相差12bp，在這瓊脂糖凝膠電泳中基本上看不出差異，這表明在實驗過程中，即使我們獲得了陽性克隆鑒定的目的大小片段，但在測序中，選取多個陽性克隆進行測序鑒定是必要的。
本研究所得所有IRI基因和已知基因具有很多保守區(qū)域，如信號肽、半胱氨酸、LRR區(qū)，而就多數(shù)重結(jié)晶抑制蛋白IRI而言，它有其自身特有的的重復(fù)IRI區(qū)(NxVxxG)和(NxVxG)，x表示在N和V之間，或則V和G之間的其它氨基酸（除了N、V、G三個氨基酸外）。這個特征區(qū)作為我們識別IRI的主要依據(jù)[38,39]，而圖4.2中顯示了我們所獲得的IRI基因之間的重復(fù)IRI區(qū)(NxVxxG)和(NxVxG)，它們都位于整個基因長度中間偏后區(qū)域，而且這些區(qū)域的重復(fù)不是直接的串聯(lián)式的重復(fù)，而是在這些重復(fù)區(qū)間內(nèi)插入了別的氨基酸。對于重復(fù)IRI區(qū)(NxVxxG)和(NxVxG)，鄧順陽等[40]在對黑麥草抗凍蛋白基因的研究中提到對IRI基因進行序列分析時，預(yù)測其有兩個冰晶結(jié)合面a面和b面，每面的模體“xxNxVxG”可能與親水性有關(guān)，都以額氨酸(V)為冰晶結(jié)合中心。預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與大部分抗凍蛋白一樣，含有類似的β-螺旋結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能與冰晶結(jié)合的表面和抑制重結(jié)晶有關(guān)[41]。
本研究所獲得的IRI基因除了具有IRI特有的特征區(qū)NxVxG/NxVxxG之外，還有其它共有的特征區(qū)域信號肽、偶數(shù)個半胱氨酸C（除B25外因為堿基突變導(dǎo)致有三個C外，其余已獲得的基因均有4個半胱氨酸C）、亮氨酸重復(fù)去LLR，這些共有的特征區(qū)
23小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
為一般功能基因所共有，但不同功能的基因其結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)部序列不同。測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的W15和B24編碼的氨基酸序列和其它6個基因相似性很低，導(dǎo)致后續(xù)基因編碼錯亂，可能直接影響這兩個IRI基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)，推測可能影響重結(jié)晶抑制蛋白的冰結(jié)晶抑制效應(yīng)等相關(guān)效應(yīng)。
24沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
參考文獻
[1]MinamiA,M.Nagao,K.Ikegami,etal.201*.Coldacclimationinbryophytes:low-temperature-inducedfreezingtoleranceinPhyscomitrellapatensisassociatedwithincreasesinexpressionlevelsofstress-relatedgenesbutnotwithincreaseinlevelofendogenousabscisicacid.Planta,220:414-423.[2]陳儒鋼，鞏振輝，逯明輝．植物抗寒基因工程研究進展[J]．西北植物學(xué)報，201*，28(6)：12741280．[3]高媛，田淑琴．抗凍蛋白新近研究進展及面臨的挑戰(zhàn)[J]．獸藥研究與應(yīng)用,201*(10)：4546．[4]李璐，王曉軍，趙安民．新疆雪蓮新的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶類冷誘導(dǎo)基因的分離、克隆和測序[J]．植物生理學(xué)通訊，201*(6)：731736．
[5]SmallwoodM，WorrallD，ByassL,eta1．Isolationandcharacterizationofanovelantifreezeproteinfromcarrot(Daucuscarota)[J]．BiochemicalJournal，1999，340：385391．
[6]MeyerK，KeilM，NaldrettMJ．Aleucinerichrepeatproteinofcarrotthatexhibitsantifreezeactivity[J]．FebsLetters，1999，447(23)：171178．[7]GriffithM，AntikainenM，HonWC，eta1．Antifreezeproteinsinwinterrye[J]．PhysiologiaPlantarum，1997，100(2)：327332．
[8]FeiYB，WeiLB，GaoSQ，eta1．Isolation，purificationandcharacterizationofsecondarystructureofantifreezeproteinfromAmmopiptanthusmongolicus[J]．ChineseScienceBulletin，201*，46(6)：495498．
[9]JiangYong，Jlashirong，F(xiàn)eiYunbiao,etal．AntifreezeⅡproteinsandtheirroleinplantantifreezephyslology[J]．ActaBotanlcaslnlca，1999．41(7)：677683
[10]GrlfflthM,AlaP,Dsc,YangDSC,etal.Antlfreezeprotelnproducedendogenouslyinwinterryeleaves[J]．PlantPhysiol.1992．100;593596
[11]UrrutlaME，DumanAG.KnightCA.Plantthermalhysteresisprotiens[J].BBA，1992，112l：199206．
[12]DumanJG.Prurificationandcharacterizationofathermalhysteresisproteinfromplant,thebittersweetnightshadeSolanumdulcamara[J].BBA1994,1206:129-135.[13]費云標(biāo)，孫龍華，黃濤．等沙冬青高活性抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)[J]植物學(xué)報，1994，36：649-650.
[14]FeiYunblao，SunLonghua，HuangTao,etal．Animportantantifreezemechanismofoverwinteringprotein(AFPs)withhlghactivityinAmmopiptanthusmonglicus[J]Cryobiology.1994，3l(6):560
[15]魏令渡，江勇，舒念紅．等．沙冬青葉片熱穩(wěn)定抗凍蛋白特性分析[J]．植物學(xué)報1999，41(8):837一841.
[16]江勇，魏令渡，費云標(biāo)，等分離和鑒定沙冬青抗凍蛋白[J]．植物學(xué)報，1999．4l(9)：967971[17]PudneyPDA，BuckleySL,sidebottomCA，etal.Thephyscio-chemicalcharacterizationofbolllngstableproteinfromaperennialgrass(Loliumperenne)[J]．ArchivesofBiochemistryandBiophyslcs，201*，410:238245．
[18]ChunJU,YuXM,GriffithM.Geneticstudiesofantifreezeproteinsandtheircorrelationwithwintersurvivalinwheat.1998
[19]張黨權(quán),譚曉風(fēng),烏云塔娜,王金發(fā)。植物抗凍蛋白及其高級結(jié)構(gòu)研究進展.中南林學(xué)院學(xué)報.Vol.25No.4[20]SansunY．BarbaraAM,MarilynG,etal.Chirinasegenesresponsivetocoldencodeantifreezeproteinsinwintercereals[J]．PlantPhysiol．201*，124：12511264．
25小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化
[21]Yuxlaomlng，GrifflthMwInterryeantlfreezeactivltyIncreasesinresponsetocoldanddrought，butnotabscisicacld[J]．Physsiol．Plant，201*，112:7886．
[22]Yuxiaoming，GriffthM.WisemanS.Ethyleneinducesantifreezeactivityinwinterryeleaves[J]．PlantPhysiol，200l，126：12321240．
[23]DeVriesAL.1986.Antifreezeglycopeptidesandpeptides:interactionwithiceandwater.MethodsEnzymol,127:293-303.
[24]江勇.1999.抗凍蛋白在植物生理中的作用.植物學(xué)報,41(7):677-685.
[25]SidebottomC,S.Buckley.201*.Heat-stableantifreezeproteinfromgrass.Nature,406(6793):249-251.[26]盧存福，簡令成，匡廷云．低溫誘導(dǎo)唐古特紅景天細(xì)胞分泌抗凍蛋白[J]．生物化學(xué)與生物物理進展，201*，27(5)：555559.
[27]MichaelJK,PeterLD,VirginiaKW．AtheoreticalmodelofaplantantlfreezeproteinfromLoliumpernenne.[J]．Biophys.J,200l，8l(6):35603565．
[28]worrallD，EliasL,AshfordD,etal．Acarrotleucine-rich-repeatproteinthatinhibitsicerecrystalliztion[J].Science,1998．282(2):115117．[29]AravA，RubinskyB,SeRenE,etal.Theroleofhysteresisprotiensduringcryopreservationofoocytesandembryos[J].Theriogenology.1994．4l(1)：107112．
[30]PayneSR,YoungOA．Effectsofpre-slaughteradministrationofantifreezeproteinsonfrozenmentqualityquality[J]．MeatSic．,1995．4l：147一155.
[31]田云．盧向陽，張海文．抗凍蛋白研究進展[J]．中國生物工程雜志，201*，22(6)：4853.[32]WarrenCJ，MuellerGM，MckownRLIcecrystalftowthsuppressionpolyptptidesandmethodsofpreparation[P]．USpatent：1992.5118：792.
[33]吳建民,幸華,趙志光,安黎哲.植物抗凍蛋白的研究進展及其應(yīng)用.[J]冰川凍土.201*.Vol.26No.4
[34]SandveGK,etal.201*.Improvedbenchmarksforcomputationalmotifdiscovery.BMCBioinformatics,8:193.
[35]KrishnanandD.Kumble,JeromeDemmer,StevenFishetal.201*.Characterizationofafamilyofice-activeproteinsfromtheRyegrass,Loliumperenne.Cryobiology,57:263-268.
[36]TremblayK.,F.Ouellet,J.Fourier,J.DanylukandF.Sarhan.201*.Molecularcharacterizationandoriginofnovelbipartitecold-regulatedicerecrystallizationinhibitionproteinsfromcereals.PlantCellPhysiol.46(6):884-891
[37]ZhangD,LiuB,FengD,HeY,WangJ(201*)Expression,puriWcation,andantifreezeactivityofcarrotantifreezeproteinanditsmutants.ProteinExpresPurif35:257263
[38]ChunzhenZhang,Shui-zhangFei,RajeevArora,DavidJ.Hannapel.201*Icerecrystallizationinhibitionproteinsofperennialryegrassenhancefreezingtolerance.Planta232:155164
[39]TremblayK,OuelletF,FournierJ,DanylukJ,SarhanF.201*Molecularcharacterizationandoriginofnovelbipartitecold-regulatedicerecrystallizationinhibitionproteinsfromcereals.PlantCellPhysiol46:884891
[40]鄧順陽,張黨權(quán),樊紹剛,谷振軍,黃青云,明付煥,祝全東,郭林林.201*黑麥草抗凍蛋白基因的cDNA克隆及序列分析.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報.V01．30N0．1
[41]WangY.201*Expressionofinsect(Microderapuntipennisdzungarica)antifreezeproteinMpAFPl49eonferathecoldtolerancetotransgenictobacco[J]．PlantCellReport.64(576)：432441．
26沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文
致謝
本研究論文在郭志富老師悉心指導(dǎo)下完成。導(dǎo)師在設(shè)計的選題試驗設(shè)計及研究內(nèi)容方面都給我以嚴(yán)格的要求和關(guān)鍵性的指導(dǎo)，設(shè)計完成后給以詳細(xì)的審閱和修改。導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、勤奮忘我的工作精神、扎實深厚的專業(yè)知識及熱情真摯的修養(yǎng)品行深深地感染著我，他言傳身教使我在學(xué)術(shù)思想、工作作風(fēng)、為人處世等諸多方面都終生受益。值此論文答辯之際，特向我的恩師致以崇高的敬意和衷心的感謝。此外，還有生物技術(shù)教研室140室給我指導(dǎo)與教誨的鐘鳴、李浩戈、陳麗靜、馬慧、林景衛(wèi)老師，郭老師課題組的白麗萍老師、農(nóng)學(xué)院的衣瑩老師，以及幫我修改英文文章的馮玉龍院長，從法國歸來的安迎鋒老師，向老師們表示我最誠摯的謝意。
實驗過程中我還要感謝那些幫助過我或者我?guī)椭^的師兄師姐，學(xué)弟學(xué)妹，因為有你們幫助，我能在一年內(nèi)把研究生階段能做的實驗快速學(xué)會，因為我能為實驗室?guī)熜謳熃慊驅(qū)W弟學(xué)妹們提供實驗幫助，我的實驗技能得以更加嫻熟。謝謝去年研三的黃國濤、齊欣、單存海、楊鋒師兄、馬爽、趙莉師姐；謝謝今年研三的閆文文、殷宇、陳啄、鐘聲、劉彥飛、曹珊、李麗麗、孫春遇、葛菱、劉曉宇、金迪；謝謝10級研究生姜躍，在我201*年6月時第一次進入實驗室做實驗，還有10級研究生張亞琳、彭丹、李麗麗、祝紅艷、劉新建、王麗、殷曉娟；當(dāng)然不能忘了07級本科生杜慧、李同同、黨曉璇，還有馬超、馬明南、孟思紋我們這些緊緊圍繞在郭老師周圍的親們；和我一樣08級的陳萍、嚴(yán)菊、王碩、劉暢、袁，09級學(xué)妹王靜宜。因為你們，我在實驗室得以專業(yè)知識、實驗技能快速提升，能參加各種生物學(xué)相關(guān)的學(xué)術(shù)講座和生物公司的技能培訓(xùn)講座，能發(fā)表英文文章，能去北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實習(xí)，能在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)做了自己大學(xué)階段最有意義的事。因為你們，我的大學(xué)生活、實驗室生活過得豐富多彩，過得充實，因為你們，我在生物找回了自己的興趣。感謝所有關(guān)心、幫助過我的同學(xué)們、朋友們!愿他們學(xué)業(yè)有成，工作順利，家庭幸福！
最后我還要感謝培養(yǎng)我長大含辛茹苦的父母，養(yǎng)育之恩，無以回報，你們永遠健康快樂是我最大的心愿。
在此論文完成、即將離開校園之際，謹(jǐn)向所有關(guān)心、支持、幫助我的各位老師、同學(xué)表示最誠摯的感謝!
27":null,"page":{"ph":1262.879,"pw":892.979,"v":6,"t":"1","pptlike":null,"cx":0,"cy":0,"cw":892.979,"ch":1262.879}})
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計承諾書
設(shè)計題目完成人姓名小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進化分析張富專業(yè)生物技術(shù)指導(dǎo)教師姓名郭志富職稱講師本畢業(yè)設(shè)計的創(chuàng)新點：1.本研究以小麥野生近緣屬種為研究材料，對植物中的IRI抗凍基因進行分離。以材料的特殊性狀為切入點進行系統(tǒng)的功能研究。2.本研究獲得的8個IRI基因與已知相關(guān)基因進行比對分析發(fā)現(xiàn)其均為新的變異類型，在抗凍功能上可能有不同表現(xiàn)，為更好的理解不同IRI基因分分子間的抗凍分子機制提供了新的參考。承諾內(nèi)容：本畢業(yè)設(shè)計是本人在導(dǎo)師郭志富老師指導(dǎo)下獨立完成的，沒有抄襲他人成果，對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明，完成人簽名：指導(dǎo)教師簽名：年月日年月日
友情提示：本文中關(guān)于《小學(xué)教師教研工作總結(jié)張富》給出的范例僅供您參考拓展思維使用，小學(xué)教師教研工作總結(jié)張富：該篇文章建議您自主創(chuàng)作。
來源：網(wǎng)絡(luò)整理 免責(zé)聲明：本文僅限學(xué)習(xí)分享，如產(chǎn)生版權(quán)問題，請聯(lián)系我們及時刪除。
公文素材庫友情提示：本網(wǎng)站所有內(nèi)容為共享上傳提供，不涉及任何商業(yè)利益，本站對此不承擔(dān)任何保證責(zé)任！
Copyright © m.seogis.com Corporation, All Rights Reserved 共享時代 共享你我他 版權(quán)所有