細胞生物學實驗報告

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細胞生物學實驗報告

動物細胞融合

【實驗目的】

⒈了解動物細胞融合的常用方法。⒉學習化學融合的基本操作過程。

⒊觀察動物細胞融合過程中細胞的行為和變化。

【實驗原理】

細胞融合是指在自發(fā)或者誘導條件下，兩個或兩個以上細胞合并為雙核或者多核細胞的過程。目前人們已經發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導細胞融合，包括病毒誘導融合、化學誘導融合和電激誘導融合。

⒈病毒誘導融合

仙臺病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導細胞的融合。這類病毒的被膜中含有融合蛋白，可介導病毒和宿主細胞融合，同時也可介導細胞與細胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導細胞發(fā)生融合。

⒉化學誘導融合

很多化學試劑能夠誘導細胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質能夠改變細胞膜脂質分子的排列，在去除這些物質之后，細胞膜趨向于恢復原有的有序結構。在恢復過程中相接觸的細胞由于接口處脂質雙分子層的相互親和與表面張力，細胞膜融合，胞質流通，發(fā)生融合。化學誘導方法，操作方便，誘導融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動、植物細胞，但對細胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學融合劑。

⒊電激誘導融合

包括電誘導、激光誘導等。其中，電誘導是先使細胞在電場中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，細胞膜的脂質分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細胞發(fā)生融合。電誘導方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒性、作用機制明確、可重復性高等優(yōu)點。

【實驗用品】

⒈材料

雞血紅細胞。⒉試劑

50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s細胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。⒊器材

正置顯微鏡、離心機、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、注射器等。

【實驗步驟】

⒈雞血紅細胞的制備和保存

用無菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再從雞翼下靜脈取血0.5~1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使總量為4~5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內。

⒉PEG誘導融合

⑴取保存的雞血，離心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化鈉溶液配制成5%~10%的懸液。

⑵稱取1gPEG放入試管內，在沸水浴中融化后，加入1ml預熱的Hank’s溶液，混勻，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

⑶取上述雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，再加入5mlHank’s溶液混勻，然后以1000r/min離心5min，小心棄去上清液，用指彈法將細胞團塊彈散。

⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min內滴加到雞紅細胞懸液中，邊加邊輕輕搖動混勻。待PEG全部加入后靜置2~5min左右。

第1頁細胞生物學實驗報告

⑸緩慢滴加6mlHank’s溶液以終止PEG的作用，混勻，靜置5min。

⑹1000r/min離心3min，棄上清液后，取一滴融合后的細胞懸液滴片，加蓋玻片鏡檢。

【實驗結果】

【分析與討論】

⒈結果分析

視野中有部分細胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，但是沒有觀察到細胞核。此外，視野中有些細胞發(fā)生重疊，是由于稀釋不足造成的。

⒉注意事項

⑴制備的雞血紅細胞懸液的濃度不宜過高，否則細胞容易聚集，融合效果受影響。

⑵在離心之前，為了防止損壞儀器，應配平離心機。具體方法為：把相對的兩個皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一個空的離心管，通過調節(jié)離心管中水的量來使天平達到平衡。

⑶在制片之前，應對細胞懸液進行充分稀釋，以免細胞發(fā)生重疊，影響觀察。⑷在制片之后，如雞血紅細胞懸液過多，則應用吸水紙吸去，以免弄臟物鏡。⑸為了觀察清楚，應把光線調暗，并改用小光圈。

【相關鏈接】

細胞融合技術的應用

⒈植物體細胞雜交

植物體細胞雜交（plantsomatic

hybridization）,又稱原生質體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質體通過人工方法誘導融合，然后進行離

體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術。植物細胞具有細胞壁，未脫壁的兩個細胞是很難融合的，植物細胞只有在脫去細胞壁成為原生質體后才能融合，所以植物的細胞融合也稱為原生質體融合。

⒉單克隆抗體

單克隆抗體是由淋巴細胞雜交瘤產生的、只針對復合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。淋巴細胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細胞（純系小鼠的腹水瘤型漿細胞）與已用抗原致敏并能分泌某種

第2頁細胞生物學實驗報告

抗體的淋巴細胞（常用致敏動物的脾細胞，起作用的是其中的B細胞）融合而成的。用來使上述淋巴細胞致敏的抗原有人和動物的T細胞、B細胞、紅細胞、腫瘤細胞、各種微生物或其他抗原物質等。這種融合細胞既具有腫瘤細胞能大量、無限繁殖的特性，又具有B細胞能合成分泌特異性抗體的能力。由于一個B細胞克隆只針對一個

抗原決定簇產生相對應的抗體，所以一個B細胞與骨髓瘤細胞融合而成的單個雜交瘤細胞，也只產生某種單一的抗體。采用適當方法把雜交瘤細胞分離出來，進行單個細胞培養(yǎng)，使之大量繁殖，則在該培養(yǎng)液中增殖而形成的細胞克隆，只產生完全均一的、單一特異性的抗體，即單克隆抗體。若把能產生特異性抗體的單克隆雜交瘤進行大量培養(yǎng)，或注入原系動物腹腔中，則雜交瘤仍以腹水型方式生長，在培養(yǎng)液或腹水中會含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術制備出來的單克隆抗體純度高、專一性強、效價高，使用時可免除不同細胞及微生物種或株間血清學上的交叉反應，大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外，在研究細胞表面標志、提純可溶性抗原、進一步研究抗體的結構和功能等方面都起著十分重要的作用。

⒊細胞治療

將自體細胞取出，經培養(yǎng)3-5周后再移植（注射）到自體的病患部位，達到替代受損細胞修復之目的，細胞治療有長期的效果，細胞能釋放自身的愈合和再生能力，治療疾�。�腫瘤；臟器；器官；疤痕；皺紋;皮膚化等）。

第3頁細胞生物學實驗報告

⒋核移植

核移植是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復制。培養(yǎng)一段時間后，在把發(fā)育中的卵母細胞移植到人或動

物體內的方法。核移植的細胞來源主要分為：供體細胞來源和受體細胞的來源兩種。核移植主要用于細胞移植和異種器官移植，細胞移植可以治療由于細胞功能缺陷所引的各種疾病。

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實驗六細胞膜的滲透性

一、實驗目的

了解細胞膜[1]的滲透性及各類物質進入細胞的速度[2]

二、實驗原理

1、在等滲溶液中，細胞對各種溶質的透過性不同。有的溶質可以進

入，有的溶質不能滲入。

2、滲入的溶質能提高細胞的滲透壓，促進水分子進入細胞，引起溶

血現(xiàn)象[3]。

3、不同的溶質滲入到細胞內的速度不同，因此溶血時間也不同。

三、實驗材料

新鮮血液（雞血、豬血、牛血等）

四、實驗器材

試管（1.5cmX18cm）、試管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml燒杯（2個）、250ml容量瓶、移液槍、膠頭滴管、菜刀、吸球、電子天平、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、秒表

五、實驗藥品及試劑0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸銨、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝劑[4]

六、實驗步驟1、制備血液稀釋液

（1）抗凝劑的制備：首先稱取1克肝素鈉粉末，然后加入0.17M

NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均勻，制成肝素抗凝劑。

（2）血液稀釋液的制備：取新鮮血液，按比例（肝素抗凝劑:血液

=1∶10）混合均勻，配制成經肝素抗凝的血液[5][6]。

（3）按比例（經肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混

合均勻，形成一種不透明的紅色液體[7]。

2、低滲溶液（空白對照）的觀察

取試管一只，加入10ml蒸餾水，然后再加入1ml稀釋的血液。注意觀察溶液顏色的變化。結果是溶液由不透明的紅色變?yōu)槌吻�。記錄下這個過程所要的時間。3、紅血球的滲透性

按表一的配制，分別在下列十種等滲溶液中進行實驗。輕輕搖動，注意有無顏色變化，是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生，記下時間（自加入稀釋血液到溶液逐漸由紅色變?yōu)橥该鞒吻澹�紅血球全部溶血所需時間），填入表一的空格中。4、顯微觀察

[1]何為細胞膜？[5]注意：這一步，動作要非常迅速，否則雞血會凝固。或者先把抗凝劑加入到燒杯中，再加入新鮮的[2]雞血，邊加邊震蕩即可。為何不同物質進入細胞的速度不同？[6]為什么新鮮的雞血會凝固？[3]何為溶血現(xiàn)象？[7]為什么這一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝劑？（1）血液紅細胞的觀察

滴一滴稀釋的血液于載玻片上，蓋上蓋玻片。用光學顯微鏡觀察細胞的種類、形狀和顏色。

（2）細胞破碎的觀察

在上一步的載玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在顯微鏡下觀察細胞的破裂。

七、實驗結果與分析

1、比較和分析你所觀察到的實驗結果，并解釋原因。

結果：

（1）在所提供的試劑中不溶血的有：

（2）在所提供的試劑中不完全溶血的有：（3）在所提供的試劑中完全溶血的有：結果分析與比較：結論：

2、繪制你所觀察到的血液細胞圖。

3、討論溶血實驗在研究中應用的可能性。附1：試劑配制表

1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸銨需要＿＿＿＿＿＿克草酸銨，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克無水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。

附2：表一在不同低滲溶液下溶血現(xiàn)象的調查

編號12345678910試劑10ml0.17MNaCl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNaNO3+1ml稀釋的雞血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀釋的雞血10ml0.12M草酸銨+1ml稀釋的雞血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀釋的雞血10ml0.32M甘油+1ml稀釋的雞血10ml0.32M乙醇+1ml稀釋的雞血10ml0.32M丙酮+1ml稀釋的雞血是否溶血時間

附3：溶血結果的判斷

（1）不溶血：液體分2層，上層淺黃色透明，下層紅色不透明，鏡檢紅細胞完好。（2）不完全溶血：溶液混濁，上層變紅色，鏡檢有部分紅細胞破裂。（3）完全溶血：液體變紅而且透明，鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞全成碎片。

附4：細胞膜內外物質交換示意圖

原始生命向細胞進化所獲得的重要形態(tài)特征之一，是生命物質外面出現(xiàn)了一層膜性結構，即細胞膜。細胞膜和細胞內膜系統(tǒng)總稱為生物膜(biomembrane)。

細胞膜(cellmembrane)，又稱原生質膜，是細胞結構中分隔細胞內、外不同介質和組成成分的界面。其厚度通常為7～8nm，由脂類和蛋白質組成。一般蛋白質占60%-80%，類脂占20%-40%，碳水化合物約占5%。關于細胞膜的結構模型，流體鑲嵌模型是目前被最廣泛接受和認可的觀點。該模型由美國加州大學的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。該模型突出了膜的流動性和不對稱性，其結構特征是：生物膜的骨架是磷脂雙分子層，其中磷脂分子的疏水性尾部相對，極性頭部朝向水相。蛋白質或嵌在脂雙層表面，或嵌在其內部，或橫跨整個脂雙層，表現(xiàn)出分布的不對稱性。根據(jù)在膜上的位置不同，膜蛋白可分為兩類：通過強疏水或親水作用同膜脂牢固結合不易分開的，稱為整合蛋白(integralprotein)或內在蛋白；附著在膜表層，與膜結合比較疏松容易分離的，稱為外周蛋白(peripheralprotein)。細胞膜的表面還有糖類分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂雙層具有流動性，故蛋白質分子也可以在脂雙層中橫向移動；又因膜的內外表面上脂類和蛋白質的分布不均勻，反映了膜兩側的功能不同。

細胞膜是細胞與周圍環(huán)境和細胞與細胞間進行物質交換和信息傳遞的重要通道。其最重要的特性是半透性，或稱選擇透過性，對進出入細胞的物質有很強的選擇透過性。這是細胞膜最基本的一種功能，如果喪失了這種功能，細胞就會死亡。細胞膜的功能有：

1)分隔形成細胞和細胞器，為細胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內環(huán)境，膜的面積大大

增加，提高了發(fā)生在膜上的生物功能；

2)屏障作用，膜兩側的水溶性物質不能自由通過；3)選擇性物質運輸，伴隨著能量的傳遞；

4)生物功能：激素作用、酶促反應、細胞識別、電子傳遞等；5)物質轉運功能：細胞與周圍環(huán)境之間的物質交換，是通過細胞膜的轉運功能實現(xiàn)的，其主要轉運方式有四種，即單純擴散、易化擴散、主動轉運、入胞和出胞作用。6)細胞膜的受體功能：受體是細胞識別和結合化學信息的特殊結構，其本質是蛋白質。實驗八細胞融合實驗目的

掌握細胞融合原理、應用PEG融合細胞的方法以及細胞融合率的計算。實驗用品

1.材料雞紅細胞

2.器材和儀器普通光學顯微鏡、普通低速離心機、恒溫水浴箱、刻度離心管、試管、載玻片、蓋玻片

3.試劑50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理鹽水實驗內容

一、原理

細胞融合(Cellfusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學的)使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。人工誘導的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術而發(fā)展起來。由于它不僅能產生同種細胞融合，也能產生種間細胞的融合，因此細胞融合技術目前被廣泛應用于細胞生物學和醫(yī)學研究的各個領域。

細胞融合的誘導物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇

(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定。PEG的促融機制尚不完全清楚，它可能引起細胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團發(fā)生結構重排。二、方法

1.取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。2.稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml預熱的37℃Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中備用。

3.取上述10％的雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，沿離心管壁滴加50％PEG溶液，邊加邊晃動試管使之混勻，37℃水浴20min。

4.取出離心管，緩慢滴加9mlHanks液以終止PEG的作用，800g離心3min，棄上清。5.用貼壁的液體重懸細胞，取一滴制成滴片，加蓋片鏡檢。結果：在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細胞膜融合在一起，形成一個異核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞。三、融合率的計算

在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數(shù)除以總細胞核數(shù)(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。公式如下：

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