細胞生物學實驗報告5

湖南科技學院實驗報告

學生姓名李詩學號201*07004215專業(yè)生物技術年級、班級1102

課程名稱細胞生物學實驗實驗指導老師蔣瓊鳳、沈玉平

細胞中過氧化物酶的顯示細胞凋亡的形態(tài)學檢測與觀察

一、實驗目的：

1.掌握顯示細胞中過氧化物酶反應的原理和方法。2.了解細胞凋亡的生物學意義

3.掌握凋亡細胞的形態(tài)學檢測方法二、實驗原理：

1.細胞內的過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物，用聯苯胺處理標本，細胞內的過氧化物酶能把聯苯胺氧化為藍色的聯苯胺藍，進而變?yōu)樽厣�產物，因而可以根據顏色反應來判定過氧化物酶的有無或多少。中間產物藍色聯苯胺是不穩(wěn)定的，無需酶的參加即可氧化為棕色化合物。

2．細胞凋亡是指細胞在生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。它是一個主動的、高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。

3.凋亡細胞形態(tài)學特征是:體積變小,細胞質濃縮;細胞核發(fā)生染色質凝聚和聚集于核膜周圍(邊緣化);細胞膜有小泡狀形成;晚期細胞膜內陷形成大小不同的凋亡小體;根據細胞凋亡形態(tài)學特征進行顯微觀察是檢測細胞凋亡的一種直觀、可靠的方法。三、實驗步驟：

細胞中過氧化物酶的顯示

1、在載片上滴一滴PBS緩沖液；

2、取骨髓細胞：用斷頸法處死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剝出后肢股骨，剪開股骨一端，用牙簽尖的一端插入剪開的小孔中，摳取少許骨髓細胞置滴有PBS的載片上；

3、涂片：用另一玻片將骨髓細胞沿一個方向涂布推開，室溫晾干；

4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸銅液，以蓋滿涂片為宜，處理30秒-1分鐘。5、傾去硫酸銅液，直接滴入聯苯胺混合液反應6分鐘（以蓋滿涂片為宜）6、清水沖洗，番紅復染2min。

7、鏡檢：清水沖洗，室溫晾干，先低倍鏡下觀察，后換高倍鏡下觀察（油鏡100×）

細胞凋亡的形態(tài)學檢測與觀察吉姆薩染色:

1、取細胞爬片置于小培養(yǎng)皿中(有細胞面朝上)2、生理鹽水輕輕漂洗細胞3、95%乙醇固定5min

4、PBS緩沖液洗2次

5、吉姆薩染色液染色5min6、蒸餾水輕輕洗去染液

7、普通光學顯微鏡下觀察。吖啶橙染色:

1、取細胞爬片置于小培養(yǎng)皿中(有細胞面朝上)2、生理鹽水輕輕漂洗細胞

3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min4、PBS緩沖液洗2次每次1min

5、0.01%吖啶橙染色液在避光環(huán)境下染色5min6、蒸餾水輕輕洗去染液

6、選用藍光激發(fā)濾片在熒光顯微鏡下觀察。四、結果與分析：

1、根據隨機選擇的幾個視野的統(tǒng)計，該樣品的細胞凋亡率=227/506×100=44.9

Hela細胞凋亡過程中核染色質的形態(tài)變化（吖啶橙染色）

五、思考題：

1、細胞凋亡的調控機制

細胞凋亡是一個受基因調控、眾多細胞膜受體和胞漿蛋白參與的細胞主動自殺過程，其觸發(fā)因素多種多樣，包括細胞內誘導因子和抑制因子對細胞凋亡的調控。

2、細胞凋亡的特征

凋亡細胞形態(tài)學特征是:體積變小,細胞質濃縮;細胞核發(fā)生染色質凝聚和聚集于核膜周圍(邊緣化);細胞膜有小泡狀形成;晚期細胞膜內陷形成大小不同的凋亡小體。

3、研究細胞凋亡的方法

定性的研究方法：常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學觀察（普通光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）

定量或半定量的研究方法：各種流式細胞儀方法、原位末端標記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

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