細胞生物學(xué)實驗報告

細胞生物學(xué)實驗報告

細胞生物學(xué)實驗報告

線粒體的活體染色與觀察

【實驗?zāi)康摹?/p>

⒈掌握線粒體活體染色原理及方法。

⒉觀察和了解動物細胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與分布特點。

【實驗原理】

⒈線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的�；铙w染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。詹納斯綠B（JanusgreenB）是線粒體的專一性活體染色劑。線粒體中細胞色素氧化酶系使染料保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。不同細胞中線粒體的形態(tài)和數(shù)目不同。在電子顯微鏡下，線粒體的外形多樣，如圓形、橢圓形、啞鈴形和桿狀。線粒體的數(shù)目與細胞類型和細胞的生理狀態(tài)有關(guān)，線粒體多聚集在細胞生理功能旺盛的區(qū)域。線粒體的細胞色素氧化酶能使詹納新綠染料始終保持在氧化狀態(tài)而呈藍色，周圍細胞內(nèi)的染料卻被還原成無色的色基，在進行細胞的體外染色時，至少要使材料在詹納斯綠B染料中染色15min后再蓋上蓋玻片，以使材料充分氧化。

⒉活體染色是指用染料標記生活有機體的細胞或組織但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示活細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，同時即不影響細胞的生命活動也不會產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化導(dǎo)致細胞的死亡�；钊炯夹g(shù)可用來研宄生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。活體染色之所以能固定、堆積在細胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起作用。堿性燃料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子；而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們被此就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料都可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料配成稀的溶液來使用。一般以堿性染料最為常用，因為堿性染料具有溶解在類脂質(zhì)的特性，易于被細胞吸收，如中性紅、詹鈉斯綠B、次甲基藍、甲苯胺藍、亮焦油紫等。其中詹鈉斯綠和中性紅兩種堿性染料是活體染色劑中最常用的染料，分別對線粒體和液泡系有特異性的染色。詹納斯綠B這種堿性染料是活體染色中重要的材料，對線粒體的染色有專一性，可專一性地對線粒體進行活染，這是由于線粒體內(nèi)的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質(zhì)中，這些染料被還原成無色的色基。

【實驗用品】

⒈材料小白鼠⒉器材

解剖盤、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片、滴管、雙凹片、小燒杯、顯微鏡。⒊試劑

1/500詹納綠B染液、Ringer試劑（NaCl：0.85%；KCl：0.03%；CaCl2：0.033%）。

【實驗步驟】

⒈用斷頭法處死小白鼠，置于解剖盤中。剪開腹腔，取出肝臟，選取邊緣較薄的肝組織0.5cm3，放入小燒杯中，用Ringer液沖洗去血污。

⒉滴加1/500詹納綠B溶液于雙凹片的凹穴中，再將上述洗凈的肝組織移入染液中，染色20-30min。以組織塊邊緣被染成藍綠色為準。

⒊吸去染液，將肝組織重置小燒杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀將組織充分剪碎制成懸液。⒋取上述細胞懸液滴片，加上蓋玻片，在高倍鏡下觀察。

【實驗結(jié)果】

第1頁細胞生物學(xué)實驗報告

⒈結(jié)果

小鼠肝細胞質(zhì)中的線粒體被染成藍綠色（理想狀態(tài)下），且分布均勻。⒉圖像

【分析與討論】

⒈結(jié)果分析

⑴在理想狀態(tài)下，小鼠肝細胞質(zhì)中的線粒體應(yīng)該被染成藍綠色，但是在實際觀察中，線粒體呈淺綠色甚至無色�？赡茉�因有：①染色時間不夠，使染色不夠充分。②肝組織塊剪得太大太厚了，使得染料透過速度太慢，最終使得大部分的細胞未染上色。③根據(jù)實驗原理要求，染色劑的濃度要求極稀。這本身就讓染色過程具有了一定難度。

⑵在顯微鏡下觀察時，可以看到紅細胞數(shù)量遠遠多于線粒體的數(shù)量。出現(xiàn)這種情況可能的原因有：①在處死小鼠時，放血不夠充分，導(dǎo)致大量血液淤留在了肝臟中，使最終視野中紅細胞過多。②取出肝組織塊后，用Ringer液未將血污沖洗干凈，使其部分殘留在肝組織塊表面，并最終混在了細胞懸液內(nèi)。

⒉討論

使用肝細胞的緣由

⑴線粒體含量較多，每個肝細胞有1000-201*個線粒體。⑵長度適合觀察，約5μm。

⑶肝臟較軟，易于破碎，并且適于快速提取，因而利于保持線粒體活性。

⑷但就以上某一條而言，均有其他部位可以替代肝臟，但若全面比較三個條件，則肝臟為最佳。⒊注意事項

⑴在從小鼠體內(nèi)取肝組織塊時要盡量快，從而能夠保證它更高的活性。

⑵染色時要使組織塊上面部分半露在染液外，不可完全淹沒，以便使線粒體酶系得到氧化。⑶在選取肝組織片時要在處于邊緣，且為由薄到厚的地方選取。

⑷染色結(jié)束后，加入的Ringer液的量不能太多，只需要剛蓋過肝組織塊即可。如果量太多，則在剪組織塊的時候會造成其上浮，從而不易剪碎。

⑸觀察前要將肝組織充分剪碎，制片時要吸取上懸液，使游離的細胞或細胞群留在載玻片上，而要避免吸取稍大的組織塊。

【拓展實驗】

人口腔黏膜上皮細胞線粒體的活體染色與觀察

Ⅰ.取干凈的載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/500詹納斯綠B染液。

Ⅱ.實驗者用牙簽在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片上的染液中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要時可再加染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

Ⅲ.在低倍鏡下，選擇平展的口腔黏膜上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進行觀察。可見扁平狀上皮細胞細胞核周圍的胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即為線粒體。

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實驗六細胞膜的滲透性

一、實驗?zāi)康?/p>

了解細胞膜[1]的滲透性及各類物質(zhì)進入細胞的速度[2]

二、實驗原理

1、在等滲溶液中，細胞對各種溶質(zhì)的透過性不同。有的溶質(zhì)可以進

入，有的溶質(zhì)不能滲入。

2、滲入的溶質(zhì)能提高細胞的滲透壓，促進水分子進入細胞，引起溶

血現(xiàn)象[3]。

3、不同的溶質(zhì)滲入到細胞內(nèi)的速度不同，因此溶血時間也不同。

三、實驗材料

新鮮血液（雞血、豬血、牛血等）

四、實驗器材

試管（1.5cmX18cm）、試管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml燒杯（2個）、250ml容量瓶、移液槍、膠頭滴管、菜刀、吸球、電子天平、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、秒表

五、實驗藥品及試劑0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸銨、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝劑[4]

六、實驗步驟1、制備血液稀釋液

（1）抗凝劑的制備：首先稱取1克肝素鈉粉末，然后加入0.17M

NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均勻，制成肝素抗凝劑。

（2）血液稀釋液的制備：取新鮮血液，按比例（肝素抗凝劑:血液

=1∶10）混合均勻，配制成經(jīng)肝素抗凝的血液[5][6]。

（3）按比例（經(jīng)肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混

合均勻，形成一種不透明的紅色液體[7]。

2、低滲溶液（空白對照）的觀察

取試管一只，加入10ml蒸餾水，然后再加入1ml稀釋的血液。注意觀察溶液顏色的變化。結(jié)果是溶液由不透明的紅色變?yōu)槌吻濉Ｓ涗浵逻@個過程所要的時間。3、紅血球的滲透性

按表一的配制，分別在下列十種等滲溶液中進行實驗。輕輕搖動，注意有無顏色變化，是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生，記下時間（自加入稀釋血液到溶液逐漸由紅色變?yōu)橥该鞒吻�，紅血球全部溶血所需時間），填入表一的空格中。4、顯微觀察

[1]何為細胞膜？[5]注意：這一步，動作要非常迅速，否則雞血會凝固�；蛘呦劝芽鼓齽┘尤氲綗�杯中，再加入新鮮的[2]雞血，邊加邊震蕩即可。為何不同物質(zhì)進入細胞的速度不同？[6]為什么新鮮的雞血會凝固？[3]何為溶血現(xiàn)象？[7]為什么這一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝劑？（1）血液紅細胞的觀察

滴一滴稀釋的血液于載玻片上，蓋上蓋玻片。用光學(xué)顯微鏡觀察細胞的種類、形狀和顏色。

（2）細胞破碎的觀察

在上一步的載玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在顯微鏡下觀察細胞的破裂。

七、實驗結(jié)果與分析

1、比較和分析你所觀察到的實驗結(jié)果，并解釋原因。

結(jié)果：

（1）在所提供的試劑中不溶血的有：

（2）在所提供的試劑中不完全溶血的有：（3）在所提供的試劑中完全溶血的有：結(jié)果分析與比較：結(jié)論：

2、繪制你所觀察到的血液細胞圖。

3、討論溶血實驗在研究中應(yīng)用的可能性。附1：試劑配制表

1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸銨需要＿＿＿＿＿＿克草酸銨，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克無水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。

附2：表一在不同低滲溶液下溶血現(xiàn)象的調(diào)查

編號12345678910試劑10ml0.17MNaCl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNaNO3+1ml稀釋的雞血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀釋的雞血10ml0.12M草酸銨+1ml稀釋的雞血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀釋的雞血10ml0.32M甘油+1ml稀釋的雞血10ml0.32M乙醇+1ml稀釋的雞血10ml0.32M丙酮+1ml稀釋的雞血是否溶血時間

附3：溶血結(jié)果的判斷

（1）不溶血：液體分2層，上層淺黃色透明，下層紅色不透明，鏡檢紅細胞完好。（2）不完全溶血：溶液混濁，上層變紅色，鏡檢有部分紅細胞破裂。（3）完全溶血：液體變紅而且透明，鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞全成碎片。

附4：細胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換示意圖

原始生命向細胞進化所獲得的重要形態(tài)特征之一，是生命物質(zhì)外面出現(xiàn)了一層膜性結(jié)構(gòu)，即細胞膜。細胞膜和細胞內(nèi)膜系統(tǒng)總稱為生物膜(biomembrane)。

細胞膜(cellmembrane)，又稱原生質(zhì)膜，是細胞結(jié)構(gòu)中分隔細胞內(nèi)、外不同介質(zhì)和組成成分的界面。其厚度通常為7～8nm，由脂類和蛋白質(zhì)組成。一般蛋白質(zhì)占60%-80%，類脂占20%-40%，碳水化合物約占5%。關(guān)于細胞膜的結(jié)構(gòu)模型，流體鑲嵌模型是目前被最廣泛接受和認可的觀點。該模型由美國加州大學(xué)的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。該模型突出了膜的流動性和不對稱性，其結(jié)構(gòu)特征是：生物膜的骨架是磷脂雙分子層，其中磷脂分子的疏水性尾部相對，極性頭部朝向水相。蛋白質(zhì)或嵌在脂雙層表面，或嵌在其內(nèi)部，或橫跨整個脂雙層，表現(xiàn)出分布的不對稱性。根據(jù)在膜上的位置不同，膜蛋白可分為兩類：通過強疏水或親水作用同膜脂牢固結(jié)合不易分開的，稱為整合蛋白(integralprotein)或內(nèi)在蛋白；附著在膜表層，與膜結(jié)合比較疏松容易分離的，稱為外周蛋白(peripheralprotein)。細胞膜的表面還有糖類分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂雙層具有流動性，故蛋白質(zhì)分子也可以在脂雙層中橫向移動；又因膜的內(nèi)外表面上脂類和蛋白質(zhì)的分布不均勻，反映了膜兩側(cè)的功能不同。

細胞膜是細胞與周圍環(huán)境和細胞與細胞間進行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道。其最重要的特性是半透性，或稱選擇透過性，對進出入細胞的物質(zhì)有很強的選擇透過性。這是細胞膜最基本的一種功能，如果喪失了這種功能，細胞就會死亡。細胞膜的功能有：

1)分隔形成細胞和細胞器，為細胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，膜的面積大大

增加，提高了發(fā)生在膜上的生物功能；

2)屏障作用，膜兩側(cè)的水溶性物質(zhì)不能自由通過；3)選擇性物質(zhì)運輸，伴隨著能量的傳遞；

4)生物功能：激素作用、酶促反應(yīng)、細胞識別、電子傳遞等；5)物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能：細胞與周圍環(huán)境之間的物質(zhì)交換，是通過細胞膜的轉(zhuǎn)運功能實現(xiàn)的，其主要轉(zhuǎn)運方式有四種，即單純擴散、易化擴散、主動轉(zhuǎn)運、入胞和出胞作用。6)細胞膜的受體功能：受體是細胞識別和結(jié)合化學(xué)信息的特殊結(jié)構(gòu)，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。實驗八細胞融合實驗?zāi)康?/p>

掌握細胞融合原理、應(yīng)用PEG融合細胞的方法以及細胞融合率的計算。實驗用品

1.材料雞紅細胞

2.器材和儀器普通光學(xué)顯微鏡、普通低速離心機、恒溫水浴箱、刻度離心管、試管、載玻片、蓋玻片

3.試劑50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理鹽水實驗內(nèi)容

一、原理

細胞融合(Cellfusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。人工誘導(dǎo)的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不僅能產(chǎn)生同種細胞融合，也能產(chǎn)生種間細胞的融合，因此細胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

細胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇

(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定。PEG的促融機制尚不完全清楚，它可能引起細胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。二、方法

1.取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。2.稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml預(yù)熱的37℃Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中備用。

3.取上述10％的雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，沿離心管壁滴加50％PEG溶液，邊加邊晃動試管使之混勻，37℃水浴20min。

4.取出離心管，緩慢滴加9mlHanks液以終止PEG的作用，800g離心3min，棄上清。5.用貼壁的液體重懸細胞，取一滴制成滴片，加蓋片鏡檢。結(jié)果：在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細胞膜融合在一起，形成一個異核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞。三、融合率的計算

在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數(shù)除以總細胞核數(shù)(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。公式如下：

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