1材料與儀器

　　1.1動物

　　SD大鼠，70只，SPF級，雌雄各半，180g左右，合格證號：0012625，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

　　1.2試劑

　　卵白蛋白批號：970612上�；瘜W(xué)試劑公司；氫氧化鋁干粉批號：20020301-2廣州化學(xué)試劑廠；滅活百日咳桿菌（100億個/ml）廣東省中醫(yī)院提供；大鼠IL-4（批號20060620）、IFN-γ（批號20060620）ELISA試劑盒由晶美生物工程有限公司提供；IL-5（批號20983008）ELISA試劑盒由BanderMedsystems提供。

　　1.3補骨脂不同溶劑提取物補骨脂95%乙醇提取物浸膏，濃度：3.45g藥材/ml（簡稱浸膏）；補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物，濃度：10.0g藥材/ml（簡稱石油醚萃取物）；補骨脂95%乙醇提取醋酸乙酯萃取物，濃度：6.67g藥材/ml（簡稱醋酸乙酯萃取物）；補骨脂95%乙醇提取水萃取物，濃度：10.0g藥材/ml（水萃取物）；補骨脂水提取物，濃度：10.0g藥材/ml（簡稱水提取物）；補骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物，濃度：2g藥材/ml（簡稱甲醇洗脫物），以上試劑均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供。

　　1.4儀器酶標(biāo)儀BIO-RADSModel550，日本；CSW-Ⅰ型超聲霧化器汕頭光電研究所；10L玻璃干燥器。

　　2方法

　　2.1分組

　　將動物隨機分成7組，10只/組：哮喘模型組（給水，1.0ml/100g）、浸膏組（藥材0.9g/100g）、石油醚萃取物組（藥材2.5g/100g）、醋酸乙酯萃取物組（藥材1.7g/100g）、水萃取物組（藥材2.5g/100g）、水提取物組（藥材10.0g/100g）、甲醇洗脫物組（藥材2.5g/100g）。以上各組動物連續(xù)灌胃給藥治療10次，1次/d。末次治療后2h，各組動物心臟采血5ml，1000r/min離心15min，血清分裝（1ml/管）保存于－70℃低溫冰箱內(nèi)待測：IL-4，IFN-γ，IL-5（嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書分別檢測）。

　　2.2卵蛋白哮喘大鼠模型的建立

　　2.2.1大鼠致敏

　　上述分組中每只動物腹腔注射抗原液0.5ml/100g(含卵蛋白100mg、氫氧化鋁干粉100mg和2.5×109個百日咳桿菌/ml,制成懸濁液)［7］致敏第1次,次日每只大鼠再次腹腔注射0.5ml/只致敏液加強。

　　2.2.2激發(fā)和治療

　　首次致敏后第15天，于每天上午8～9時大鼠置于10L玻璃干燥器內(nèi)超聲霧化吸入2%卵蛋白20min激發(fā)哮喘,連續(xù)14d。激發(fā)后第4天起，于每天激發(fā)后大鼠口服給相應(yīng)試劑治療（見“2.1實驗分組”）。正常組以生理鹽水取代抗原液按0.5ml/100g腹腔注射致敏大鼠，第2天以0.5ml/只腹腔注射生理鹽水加強；首次致敏后第15天，每天上午8～9時該組大鼠超聲霧化吸入生理鹽水20min激發(fā)哮喘,連續(xù)14d。激發(fā)后第4天起，于每天激發(fā)后大鼠口服給蒸餾水治療。

　　2.3統(tǒng)計分析結(jié)果

　　采用四川大學(xué)黃志勇主編的（PEMS3.0）《中國醫(yī)學(xué)百科全書·醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)》統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計：兩組均數(shù)比較t檢驗（方差齊）或t′（方差不齊）。

　　3結(jié)果

　　3.1補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠IL-5含量的影響結(jié)果見表1。由表1可見，大鼠服用補骨脂不同溶劑提取物后，血清IL-5含量呈下降趨勢，其中補骨脂浸膏、水萃取物、水提取和甲醇洗脫物各成分組大鼠血清IL-5含量降低明顯，與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01，差異有顯著意義。而石油醚和醋酸乙酯萃取物兩成分組大鼠血清il-5含量降低不明顯，與哮喘模型組比較p>0.05，無顯著性差異。

　　3.2補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠IL-4含量的影響結(jié)果見表1。由表1可見，大鼠服用補骨脂不同溶劑提取物后，血清IL-4含量呈升高趨勢，其中補骨脂浸膏、石油醚萃取物和水提取物各成分組大鼠血清IL-4含量升高明顯，與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01，差異有顯著意義。而醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脫物三成分組大鼠血清il-4含量升高不明顯，與哮喘模型組比較p>0.05，無顯著性差異。

　　3.3補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠IFN-γ含量的影響結(jié)果見表1。由表1可見，大鼠服用補骨脂不同溶劑提取物后，不同溶劑成分大鼠血清IFN-γ含量升降不一致，其中補骨脂浸膏和石油醚萃取物兩成分組大鼠血清IFN-γ含量升高明顯，與哮喘模型組比較P<0.05，差異有顯著意義。醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脫物三成分組大鼠血清IFN-γ含量減低顯著，與哮喘模型組比較P<0.05或P<0.01，有顯著性差異，而補骨脂水提對ifn-γ含量未見明顯影響，與哮喘模型組比較p>0.05，無顯著性差異。表1不同提取物對哮喘大鼠IL-5，IL-4，IFN-γ含量的影響(略)

　　3.4補骨脂不同溶劑提取物對哮喘大鼠Th1/Th2（IFN-γ/IL-5）的影響哮喘模型組、醇提浸膏組、石油醚萃取組、甲醇洗脫物組和水提取物組的Th1/Th2比值依次為（n=10)：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5，0.8±0.4和1.2±0.5。提示，大鼠服用補骨脂醇提上述4種溶劑萃取物后，血清Th1/Th2比值呈增加明顯，與哮喘模型組比較P<0.05，差異有顯著意義。而醋酸乙酯萃取物（0.4±0.2，n=10）和水萃取物（0.6±0.2，n=10）兩成分組大鼠血清Th1/Th2降低或增加不明顯，與哮喘模型組比較P＞0.05，無顯著性差異。

　　4討論

　　哮喘與Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子及Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4，IL-5等細(xì)胞因子含量和Th1/Th2比值密切相關(guān)。Th2的主要代表產(chǎn)物IL-4，能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，引發(fā)炎癥介質(zhì)釋放的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化聚集，引起呼吸道血管通透性增加和粘膜水腫，平滑肌痙攣及粘液分泌亢進(jìn)，是引起哮喘的重要因素。Th1的主要代表產(chǎn)物是IFN-γ，能抑制IL-4，IL-5等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制IgE的產(chǎn)生和Eos活性，抑制IAR和LAR，是哮喘免疫調(diào)節(jié)中的一個重要的抑制因子，許多細(xì)胞因子通過它發(fā)揮生物效應(yīng)［8］。因此，采用IFN-γ，IL-5，IL-4作為哮喘敏感指標(biāo)進(jìn)行藥物篩選具有合理性。補骨脂是臨床上常用的補腎助陽中藥，具平喘之功，臨床上常用于虛寒喘咳［9］。補骨脂是今后應(yīng)加強研究和開發(fā)的抗氣道抗炎癥中藥之一［2］。我院從20世紀(jì)80年代初使用補骨脂注射液治療支氣管哮喘取得了理想的療效，但其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)并不清楚。因此，我們在前期研究的基礎(chǔ)上［2，3］，采用卵蛋白哮喘大鼠為模型，以體內(nèi)血清IFN-γ/IL-4/IL-5含量變化為指標(biāo)，初步篩選補骨脂平喘作用的有效部位。

　　從IFN-γ含量變化來看，補骨脂95%乙醇提取物浸膏和補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物作用明顯，可能是補骨脂平喘的主要成分，但從抑制IL-5和IL-4含量分析，補骨脂95%乙醇提取水萃取物和補骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物對Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4，IL-5細(xì)胞因子有較強的抑制作用，其他成分卻升高或?qū)�IL-5，IL-4沒有顯著影響，而補骨脂水提取物對IFN-γ含量提高作用不明顯。另外，補骨脂95%醇提水萃取物顯著降低IL-5和IFN-γ含量，同時在給藥的過程中我們發(fā)現(xiàn)水萃取物的毒性明顯強于其他成分，這與其腎毒性是否相關(guān)值得關(guān)注。根據(jù)以上分析，我們初步推測補骨脂平喘有效部位應(yīng)該主要是醇提成分：補骨脂95%乙醇提取物浸膏，補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物和甲醇洗脫物。

　　從哮喘中考察Th1/Th2的比值變化更具有意義［10］，因此我們以IFN-γ/IL-5為例，分析Th1/Th2的變化，探討補骨脂3個醇提成分（浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脫物）哪個為平喘的最佳有效部位。哮喘模型組、醇提浸膏組、石油醚萃取物組和甲醇洗脫物組的Th1/Th2依次為（n=10）：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5和0.8±0.4，與哮喘組比較三者的P<0.05，差異有顯著意義，但醇提浸膏的比值更大。因此結(jié)合前面的分析，我們認(rèn)為三者的平喘作用大小依次為：補骨脂95%乙醇提取物浸膏>補骨脂95%乙醇提甲醇洗脫物=補骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物。

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　　［9］柴瑞霽.溫腎助陽化痰飲，攝納腎氣平喘咳-補骨脂治療虛寒喘咳的體會［J］.山西中醫(yī)，1997，13（4）：49.

　�。�10］鄧時貴，韓凌，李偉英.總香豆素對卵蛋白致敏哮喘大鼠血清Th1/Th2的影響［J］.中國現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)雜志，2005，4(8)：1.

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