65細(xì)菌室工作流程

細(xì)菌室工作流程

檢驗(yàn)醫(yī)師按照標(biāo)本采取規(guī)定進(jìn)行標(biāo)本采取采取的標(biāo)本立即送往檢驗(yàn)科微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備檢驗(yàn)對(duì)檢驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行檢查排序培養(yǎng)基配制及無(wú)菌試驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)基通過(guò)性能測(cè)試采取標(biāo)本接種細(xì)菌分型鑒定特殊菌種保存特殊菌種上報(bào)專業(yè)主管標(biāo)本按照規(guī)定儲(chǔ)存上報(bào)檢驗(yàn)科主任專業(yè)主管對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果審核檢驗(yàn)醫(yī)師對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果登記將報(bào)告送至住院患者所在臨床科室對(duì)有疑問(wèn)的檢驗(yàn)結(jié)果，召開全科人員討論研究，得出共識(shí)結(jié)果，并將所有資料存檔急診患者檢驗(yàn)報(bào)告由檢驗(yàn)科電話向急救中心值班醫(yī)師報(bào)告1

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細(xì)菌室工作流程簡(jiǎn)介一、標(biāo)本接種與涂片染色（一）標(biāo)本的接種：

⑴培養(yǎng)基選擇及接種方式：

標(biāo)本類型培養(yǎng)基組合接種方式

痰、咽拭子血平皿+中國(guó)藍(lán)平皿+流感嗜血桿菌平皿三區(qū)劃線法尿血平皿+中國(guó)藍(lán)平皿血：直、曲線法，中：三區(qū)劃線法

分泌物血平皿+中國(guó)藍(lán)平皿三區(qū)劃線法大便SS平皿+TCBS平皿三區(qū)劃線法輸液液體、腹水、普通肉湯管直接傾倒膽汁、胃液、膿液等

血、腦脊液、骨髓、血培養(yǎng)瓶用注射器注入胸水、關(guān)節(jié)液

培養(yǎng)類別選擇性培養(yǎng)基接種方式真菌沙氏培養(yǎng)基直接劃線淋球菌巧克力淋球菌培養(yǎng)基直接劃線結(jié)核桿菌羅氏結(jié)核菌培養(yǎng)管直接劃線L型細(xì)菌高滲肉湯培養(yǎng)管直接接種霍亂弧菌堿性蛋白胨培養(yǎng)管直接接種⑵血培養(yǎng)瓶選擇如下：

培養(yǎng)瓶瓶的顏色抽血量（ml）標(biāo)準(zhǔn)需氧培養(yǎng)瓶藍(lán)色510標(biāo)準(zhǔn)厭氧培養(yǎng)瓶紫紅色510中和抗生素需氧培養(yǎng)瓶綠色510中和抗生素厭氧培養(yǎng)瓶橙黃色510小兒血培養(yǎng)瓶淺黃色12結(jié)核桿菌血培養(yǎng)瓶黑色510（二）標(biāo)本涂片和染色1、看濕片（未染色片）：

⑴正常人體的下呼吸道是無(wú)菌的，上呼吸道有正常菌群棲居。下呼吸道標(biāo)本來(lái)源有多種：痰、支氣管肺灌洗吸出液、氣管抽出液或刷子、肺穿刺或活組織等。

痰標(biāo)本在接種前需涂片鏡檢，以確認(rèn)留取的標(biāo)本是否有臨床意義。在低倍鏡下計(jì)數(shù)每低倍視野白細(xì)胞和上皮細(xì)胞的平均數(shù)目，按照以下標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)本是否適合做培養(yǎng)：

白細(xì)胞上皮細(xì)胞是否適合A：＞25＜10是B：＞25＜25是C：＜10＞25否不合格的標(biāo)本應(yīng)電話告訴臨床科室重留標(biāo)本。⑶霍亂弧菌（投標(biāo)樣動(dòng)力，運(yùn)動(dòng)似流星）2、革蘭氏染色：

⑴涂片革蘭氏染色找細(xì)菌：革蘭氏陽(yáng)性菌：球菌（G+C）、桿菌少（G+b）革蘭氏陰性菌：桿菌（G-b）、球菌少（G-C）⑵涂片革蘭氏染色找真菌：找菌絲、孢子⑶菌群分析：大便標(biāo)本球、桿菌比例。

備注：加德納爾氏菌是細(xì)菌性陰道癥的主要致病菌之一，此癥有如下特點(diǎn)：

1)陰道排出物過(guò)多；2)陰道PH＞4.5；

3)陰道上皮細(xì)胞被G-小b覆蓋形成為線索或線球細(xì)胞；

4)KOH試驗(yàn)陽(yáng)性：陰道分泌物滴加10%KOH后，立即出現(xiàn)魚腥味和氨味；

3、抗酸染色：

查找抗酸桿菌。如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌。4、墨汁染色：

查找新型隱球菌。特點(diǎn)：有莢膜，夾膜折光性強(qiáng)。5、看菌落形態(tài)：1.肉眼看：

血平皿上：有臍窩狀的可能是草綠色鏈球菌，微黃色可能是奈瑟氏菌，干燥的可能是真菌，乳白色的可能是葡萄球菌，濕潤(rùn)的可能是腸球菌。中國(guó)藍(lán)上：微黃色可能是奈瑟氏菌，有選擇性地促進(jìn)革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)，發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌因分解乳糖能力不同，在此平皿上的菌落顏色不同。

流感嗜血桿菌平皿上：微黃色可能是奈瑟氏菌，（三）轉(zhuǎn)種：

1.陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶：1）涂片革蘭氏染色：找到細(xì)菌→向臨床科室報(bào)告；未找到細(xì)菌→暫不報(bào)告，待轉(zhuǎn)種生長(zhǎng)后再報(bào)；2）轉(zhuǎn)種：血平皿、中國(guó)藍(lán)平皿。

2.肉湯管：1）培養(yǎng)3天后仍然透明清亮：轉(zhuǎn)種血平皿一個(gè)；2）渾濁：轉(zhuǎn)種血平皿、中國(guó)藍(lán)平皿各一個(gè)。二、細(xì)菌鑒定（視標(biāo)本、科室而定）

（一）標(biāo)本培養(yǎng)的菌落計(jì)數(shù)及有意義菌落的篩選1、痰：

（1）菌落計(jì)數(shù)

1）只有第一區(qū)生長(zhǎng)，計(jì)103/ml；

2）第一、二區(qū)生長(zhǎng)，第三區(qū)不長(zhǎng)，計(jì)105/ml；3）三個(gè)區(qū)均生長(zhǎng)，計(jì)107/ml；（2）菌落篩選

1）＜103/ml：視科別而定，除ICU、CCU、急診科、老年科和呼吸科危重病號(hào)外，一般報(bào)告為：無(wú)致病菌生長(zhǎng)；

2）＝103/ml：除非細(xì)菌生長(zhǎng)較純或可能為葡萄球菌需進(jìn)一步處理外一般報(bào)告為：無(wú)致病菌生長(zhǎng)；

3）＞103/ml：①根據(jù)菌落形態(tài)將其中意義不大的標(biāo)本報(bào)告單發(fā)出，一般報(bào)告為：無(wú)致病菌生長(zhǎng)；微黃色報(bào)告奈瑟氏菌；

血平皿上有臍窩狀可能為草綠色鏈球菌，需做如下鑒定：4）血平皿：草綠色鏈球菌做OPTOCHIN；中國(guó)藍(lán)：真菌（YBC）轉(zhuǎn)沙氏、種芽管。2、尿：

1）菌落計(jì)數(shù)：

定量接種環(huán)涂抹法：用10μl定量接種環(huán)取一環(huán)尿液在血平皿上做均勻劃線接種，置于35℃24h培養(yǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的菌落數(shù)，再乘以100，即為每毫升菌落數(shù)。菌落生長(zhǎng)過(guò)多不可計(jì)數(shù)時(shí)，報(bào)告＞105cfu/ml。

2）一般情況下細(xì)菌數(shù)不會(huì)超過(guò)103cfu/ml，診斷泌尿系感染的細(xì)菌學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是：菌落計(jì)數(shù)≥105cfu/ml。3、前列腺液：

1）密集生長(zhǎng)→分純（選乳白色的菌落）→鑒定2）偶有生長(zhǎng)→報(bào)告為：無(wú)致病菌生長(zhǎng)3）無(wú)菌生長(zhǎng)→報(bào)告為：無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)4、大便：

中國(guó)藍(lán)及SS平板：找細(xì)小、無(wú)色、透明的菌落→KIA試驗(yàn)＋：血清學(xué)鑒定

－：報(bào)告無(wú)致病菌生長(zhǎng)

TCBS平板：黃色菌落→氧化酶：+：O/F試驗(yàn)：＋：上機(jī)藥敏－：報(bào)告無(wú)致病菌生長(zhǎng)

－：很少，可能為梅氏弧菌，報(bào)告無(wú)致病菌生長(zhǎng)

5、其他標(biāo)本（血、腦脊液、靜脈管等）的細(xì)菌鑒定：一般不需計(jì)數(shù)，只要有細(xì)菌生長(zhǎng)（污染菌除外），就需進(jìn)行鑒定處理。三、鑒別試驗(yàn)：

1、血平板（鏈球菌屬）細(xì)小、圓形、表面光滑、灰白色、半透明（1）選血平皿上有臍窩狀的菌落（可能是草綠色鏈球菌）：在血平皿上做OPTOCHIN（奧卜托欣）試驗(yàn)：1）＋：報(bào)告肺炎鏈球菌2）－：報(bào)告草綠色鏈球菌

（2）牛奶美藍(lán)試驗(yàn)：1）＋：糞腸球菌2）－：手工生化反應(yīng)組鑒別菌類

（3）衛(wèi)星現(xiàn)象（用金黃色葡萄球菌做）：

1）血平皿：＋：流感或付流感→M-H平皿：＋：付流感：無(wú)致病菌生長(zhǎng)

－：無(wú)致病菌生長(zhǎng)－：流感2）細(xì)菌與生長(zhǎng)因子：

血平皿上有V+X因子，（藥平皿）M-H平皿上有V因子。細(xì)菌名稱所需生長(zhǎng)因子流感嗜血桿菌Ⅴ+Ⅹ付流感嗜血桿菌Ⅴ杜克氏菌Ⅹ2、涂片：

陽(yáng)性桿菌→上機(jī)BAC卡陽(yáng)性球菌→做觸酶（H2O2）陰性桿菌→做氧化酶（OX）

真菌（YBC）→轉(zhuǎn)沙氏（分純）、種芽管（看是不是白色念珠菌）可疑金黃色葡萄球菌要加做凝固酶加以確定

3、用KOH（氫氧化鉀）拉絲試驗(yàn)（鑒別陰性菌還是陽(yáng)性菌）拉絲＋：是陰性菌拉絲－：是陽(yáng)性菌4、觸酶（H2O2）：

先挑取菌落1個(gè)，加1滴H2O2，馬上出現(xiàn)氣泡的為陽(yáng)性，其次為陰性。在革蘭氏陽(yáng)性菌中，鏈球菌觸酶試驗(yàn)陰性，葡萄球菌、微球菌均陰性。5、凝固酶：

可疑為金黃色葡萄球菌做凝固酶：100ul血漿＋300ul生理鹽水＋1個(gè)菌落。

6、上機(jī)、藥敏：

G-b做氧化酶，G+C做觸酶（CAT）

革蘭氏陰性菌G-b要做氧化酶（試紙片法）。

中國(guó)藍(lán)上生長(zhǎng)G-b的菌落（非真菌）：氧化酶＋：上機(jī)GNI反應(yīng)卡涂黑→●、革蘭氏陰性菌藥敏3板（①②③）

氧化酶－：上機(jī)GNI反應(yīng)卡→、革藍(lán)氏陰性菌藥敏4板（①②③④）

中國(guó)藍(lán)不生長(zhǎng)G+C的白色菌落做觸酶：1）＋→凝固酶：

玻片法＋→試管法＋：報(bào)金黃色葡萄球菌、G＋藥敏＋葡萄球菌＋（OX）苯唑－：上機(jī)GPI○、G＋藥敏＋葡萄球菌＋（OX）苯唑西林－：上機(jī)GPI○、G＋藥敏＋鏈球菌

2）－：牛奶美藍(lán)1）＋：糞腸球菌、腸球菌藥敏2）－：手工生化反應(yīng)組鑒別菌類

7、種芽管（鑒定是否是白色念珠菌）同時(shí)轉(zhuǎn)沙氏：種芽管：300ul血清＋1個(gè)真菌菌落

1）＋：報(bào)告為白色念珠菌不用上機(jī)→直接做真菌藥敏；

2）－：上機(jī)YBC（真菌）卡室溫放置24h后放入檢測(cè)儀，如不能鑒定其種屬，需再室溫放置24h后放入檢測(cè)儀鑒定，如仍不能鑒定其種屬則需做手工生化鑒定→真菌藥敏。四、分純

平板上不純的菌落經(jīng)涂片

1）一般原則是血→血，中國(guó)蘭→中國(guó)蘭，沙氏→沙氏。2）革蘭氏陽(yáng)性菌：轉(zhuǎn)血平板；3）革蘭氏陰性菌：轉(zhuǎn)中國(guó)蘭；4）真菌：轉(zhuǎn)沙氏培養(yǎng)基。五、上機(jī)藥敏

1、常用的幾種生化反應(yīng)卡

1）革蘭氏陰性菌：GNI反應(yīng)卡，將菌液充入卡中直接上機(jī)；2）革蘭氏陽(yáng)性球菌：GPI反應(yīng)卡，將菌液充入卡中直接上機(jī)；3）革蘭氏陽(yáng)性桿菌：BAC反應(yīng)卡，將菌液充入卡中直接上機(jī)；

4）真菌：YBC反應(yīng)卡，將菌液充入卡中于室溫放置24h后再上機(jī)讀卡。2、上機(jī)孔標(biāo)記：

1）革蘭氏陰性菌：GNI反應(yīng)卡，氧化酶陽(yáng)性（○→●）2）革蘭氏陰性菌：GNI反應(yīng)卡，氧化酶陰性（○→○）3）革蘭氏陽(yáng)性菌：GPI反應(yīng)卡，觸酶陽(yáng)性（○→●）4）革蘭氏陽(yáng)性菌：GPI反應(yīng)卡，觸酶陰性（○→○）5）BAC反應(yīng)卡：不需涂黑

6）YBC反應(yīng)卡：室溫放置24h，讀卡，（○→●）室溫放置48小時(shí)。3、藥敏

1）革蘭氏陰性菌：氧化酶：＋：1、2、3號(hào)革蘭氏陰性菌藥敏板－：1、2、3、4號(hào)革蘭氏陰性菌藥敏板

2）革蘭氏陽(yáng)性球菌：觸酶：＋：1革蘭氏陽(yáng)性菌藥敏板、葡萄球菌藥敏板及苯唑西林（OX）

－：1號(hào)革蘭氏陽(yáng)性菌藥敏板、鏈球菌藥敏板

3）革蘭氏陽(yáng)性桿菌：一般不做藥敏，如臨床醫(yī)生要求，則使用Etest法判讀最小抑菌濃度MIC。4）真菌：1、2號(hào)真菌藥敏板5）ESBL：

4、次日測(cè)量藥敏結(jié)果并在計(jì)算機(jī)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中查記鑒定出的前一天上機(jī)細(xì)菌的菌名，如非真菌類細(xì)菌未被鑒定出，則須人工查閱鑒定手冊(cè)，如仍不能查出，可進(jìn)行手工生化鑒定或重新上機(jī)；如真菌類細(xì)菌未被鑒定出，則須將生化反應(yīng)卡再于室溫放置24h后上機(jī)讀卡即可獲得結(jié)果。六、報(bào)告結(jié)果

1）將中文菌名印于原始化驗(yàn)單上；

2）對(duì)于痰標(biāo)本培養(yǎng)，將其濕片結(jié)果及菌落計(jì)數(shù)印于化驗(yàn)單上；對(duì)于尿標(biāo)本培養(yǎng)，將其菌落計(jì)數(shù)印于化驗(yàn)單上；

3）打印非真菌（革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌）藥敏單，貼于化驗(yàn)單上；4）打印真菌藥敏單，貼于化驗(yàn)單上；

5）超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）陽(yáng)性的要在報(bào)告單上注明；

6）將報(bào)告日期、報(bào)告者姓名印于化驗(yàn)單，然后在登記本上記錄結(jié)果，最后向臨床科室發(fā)出報(bào)告單（包括化驗(yàn)單和藥敏單）。七、其他項(xiàng)目（一）接種項(xiàng)目

1、淋球菌培養(yǎng)：35℃48h培養(yǎng)后，細(xì)小、透明似水滴狀，凸起、光滑、圓形、無(wú)色素菌落→氧化酶（1）＋：糖類分解試驗(yàn)及有關(guān)試驗(yàn)：葡萄糖（＋）麥牙糖、乳糖、蔗果糖、硝亞硝（）多糖體合成及DNA酶（－）（2）－：報(bào)告為無(wú)淋球菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性的要加做紙片法藥敏。2、L型細(xì)菌：由串珠狀鏈桿菌變異而來(lái)，形態(tài)及染色性多變，最突出的特點(diǎn)是細(xì)胞壁缺失，確認(rèn)通�？坑^察菌落形態(tài)和染色性。低倍鏡下：細(xì)胞壁缺失的細(xì)菌

⑴典型的L型：“油煎蛋”樣菌落，中心部位致密，透光度差，嵌入生長(zhǎng)，周圍透明；

⑵不典型的G型：比L型菌落大，無(wú)透光度差的核心，整個(gè)菌落呈透明顆粒狀；

⑶不典型的F型：菌落有時(shí)可見致密核心，其周邊或全部由長(zhǎng)絲構(gòu)成；⑷備注：L型細(xì)菌具“返祖”特性，利用此點(diǎn)可與支原體（不返祖）相鑒別，而且只有反祖后才能進(jìn)行種別鑒定，其對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗生素（如青霉素、頭孢霉素等）常有耐藥性，而能干擾細(xì)菌蛋白合成的抗生素（如卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等）對(duì)L型細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)。3、支原體培養(yǎng)專用肉湯管：1）紅色清亮透明：報(bào)告為有尿素支原體生長(zhǎng)；

2）紅色渾濁：可能有其他細(xì)菌污染，報(bào)告為無(wú)支原體生長(zhǎng)；3）培養(yǎng)3天后不變紅、保持原色，報(bào)告為無(wú)支原體生長(zhǎng)；

4）藥敏有專用試劑盒：判斷藥敏結(jié)果的方法與判斷有無(wú)支原體生長(zhǎng)的方法基本相同：顏色變紅的為耐藥，即生長(zhǎng)；顏色不變的為敏感，即不長(zhǎng)；藥物濃度高的不變色，濃度低的變紅為中介，即在高濃度的藥物中不生長(zhǎng)，而在低濃度的藥物中可生長(zhǎng)。4、空氣培養(yǎng)（計(jì)數(shù)）：

所有平板的菌落數(shù)之和÷平板數(shù)×157＝報(bào)告結(jié)果。（二）試劑盒項(xiàng)目（免疫法）原理：抗原抗體反應(yīng)，凝集反應(yīng)。

沙眼衣原體抗原（免疫法）肺炎支原體抗體（免疫法）肺炎衣原體抗體（免疫法）軍團(tuán)菌抗體（免疫法）八、細(xì)菌培養(yǎng)基制備（一）平板基礎(chǔ)液

血平皿中國(guó)藍(lán)平皿藥敏平皿空氣平皿沙氏平皿SSTCBS（二）肉湯管

普通肉湯管高滲肉湯管堿性蛋白胨管支原體肉湯管（三）斜面羅瓊氏培養(yǎng)基（結(jié)核桿菌培養(yǎng)基）枸櫞酸鹽管雙糖管（四）生化反應(yīng)管糖類氨基酸類醇類其他

（五）倒好培養(yǎng)基后要做無(wú)菌試驗(yàn)（六）儲(chǔ)存于冰箱冷藏備用。

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