本實驗在2個方面體現(xiàn)創(chuàng)新設(shè)計:

　　(1)走出課堂,面向林業(yè)生產(chǎn)實際。從生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)問題,獲取的實驗材料,更具針對性,理論與實踐緊密結(jié)合,增強了學(xué)生的興趣和參與意識。

　　(2)實驗材料多樣性,根據(jù)農(nóng)林高校生源多來自農(nóng)村、學(xué)生獲取植物材料較容易的特點,每小組采集的材料來自不同生態(tài)區(qū)域,實驗結(jié)果豐富多樣,學(xué)生組別間可相互學(xué)到更多的知識,提高了學(xué)習(xí)效率。

　　實驗學(xué)時與安排

　　本實驗具有季節(jié)性、綜合性和持續(xù)性的特點,選擇在春季5~7月,實驗總學(xué)時15學(xué)時,分5次進(jìn)行,每次教學(xué)指導(dǎo)20min,采用小結(jié)實驗進(jìn)度和答疑方式。學(xué)生查閱資料、編制方案及實驗報告不計入學(xué)時,根據(jù)報告內(nèi)容和新穎性推薦發(fā)表。

　　實驗方法

　　1樣品采集與前處理

　　學(xué)生實驗前按5人1組分組,通過社會實踐或生源地了解林木病害發(fā)生情況,實地采集或郵寄林木病害分離用標(biāo)本,并填寫好“林木病害調(diào)查記載卡(見圖1)”。記載卡記錄病害發(fā)生的生態(tài)環(huán)境因子、林地管理情況,對分析發(fā)病原因至關(guān)重要。采集標(biāo)本注上標(biāo)記后,如不能及時分離,要用塑料袋分類裝好,冰箱中低溫保存?zhèn)溆靡苑罉悠纷冑|(zhì)。

　　2培養(yǎng)基制作培養(yǎng)

　　不同的病原菌,要根據(jù)它們的需求配制適宜的培養(yǎng)基,對營養(yǎng)有特殊要求的病原菌還要配制特定的選擇性培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的種類很多,截至1930年,已經(jīng)報道了將近2500種。學(xué)生要對所診斷的病害性質(zhì)有一基本了解,如真菌病害或細(xì)菌病害,選擇適宜培養(yǎng)基制作。因此,同學(xué)們在實驗設(shè)計時應(yīng)選擇馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基分離真菌或肉汁凍培養(yǎng)基分離細(xì)菌。由于該步驟要加熱和高壓蒸汽滅菌,有一定危險性,除安全教育外,還要求學(xué)生不能在滅菌期間離開實驗室。馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基制作時,先將洗凈后去皮的馬鈴薯200g切碎,加水1000ml煮沸0.5h,用紗布濾去馬鈴薯,再加水補足1000ml;然后加葡萄糖或蔗糖10~20g和瓊膠17~20g,加熱使瓊膠完全熔化后,趁熱用紗布或脫脂棉過濾,或者用濾紙和保溫漏斗過濾。而后分裝試管,加棉花塞后滅菌。作平板培養(yǎng)的每管約10ml,作斜面培養(yǎng)的則每管約5ml。根據(jù)工作需要,還可以分裝在三角瓶中滅菌。

　　教師必須在實驗前說明,高壓滅菌器的用法和注意事項:

　　(1)滅菌器中的水,應(yīng)加水到指定的標(biāo)度;

　　(2)需要滅菌的器物放在滅菌器內(nèi),將蓋密閉,打開氣門;

　　（3)加熱,等空氣完全排除后(蒸汽從氣門有力地沖出),關(guān)閉氣門;

　　(4)當(dāng)壓力上升到所需要的指標(biāo)后,開始計算滅菌的時間,滅菌過程中保持壓力不變;

　　(5)達(dá)到需要滅菌的時間,停止加熱,稍微打開氣門,排出蒸汽使壓力慢慢下降;(6)當(dāng)壓力降到內(nèi)外相等時,才能打開高壓滅菌器的蓋。肉汁凍培養(yǎng)基的方法:取3g牛肉浸膏,蛋白胨5~10g,瓊膠17~20g,水1000ml,與馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基的方法相同,這里不再贅述。

　　3分離培養(yǎng)

　　(1)超凈工作臺清毒與分離材料的選擇。分離和培養(yǎng)應(yīng)該在很清潔的條件下進(jìn)行。打開超凈工作臺紫外燈滅菌30min,殺死空氣中的微生物,關(guān)燈5~10min,再進(jìn)行分離。

　　(2)組織分離法分離真菌。病原真菌的分離一般都是用組織分離法[3],是林學(xué)、森保專業(yè)學(xué)生必須掌握的技術(shù)。要求學(xué)生從上述采集的標(biāo)本中,選擇新近發(fā)病的植株、器官或組織作為分離的材料,可以減少腐生菌的污染。腐生菌容易在生病很久而已經(jīng)枯死或敗壞的部分滋生,所以一般斑點病害應(yīng)該從鄰近健全的組織的部分分離。在超凈工作臺上,從病斑切取每邊約5mm的小塊病組織,用70的酒精浸幾秒鐘,再在0.1的酸性升汞水溶液中浸3~5min;而后用滅菌水換洗3次,將其移置在上述馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。用蠟筆在培養(yǎng)皿上注明分離材料日期后送入25℃溫箱反轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿培養(yǎng);3~5d,在培養(yǎng)基上選擇純的菌落,移植到新的平面上或斜面上培養(yǎng)并純化,并計算各分離真菌百分率。以優(yōu)勢菌群作為回接實驗菌種。

　　(3)平板劃線分離法分離細(xì)菌。平板劃線法[3]是分離細(xì)菌的常見方法,取小塊病組織,經(jīng)過表面消毒和滅菌水洗過2次以后,放在滅菌載玻片上的滅菌水中,用滅菌玻棒研碎。靜置一定時間,用滅菌的移植環(huán)蘸取以上組織液在肉汁凍培養(yǎng)基瓊膠平板上劃線培養(yǎng);先在平板的一側(cè)順序劃3~5條線,再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60°,將移植環(huán)滅菌后,從第2條線末端,順序劃出3~5條線。也有其他劃線的形式,如4分劃線和放射劃線等,目的都是使細(xì)菌分開形成分散的菌落,并計算各分離細(xì)菌百分率,以優(yōu)勢菌群作為回接實驗菌種。

　　4病原回接與再分離

　　病害的種類很多,其傳染方式也各不相同,因此要用相應(yīng)的接種方法。種子、土壤、氣流和昆蟲等傳染的病害,接種方法是不同的。因此,指導(dǎo)老師要求學(xué)生在進(jìn)行試驗前,對一種病害在自然條件下的傳染方式和侵染途徑有所了解。一般氣流和雨水傳播病害較普遍,可采用噴霧法進(jìn)行。將上述真菌孢子(或菌絲)懸浮液噴灑在寄主表面,并用濕紗布保濕3d,病菌可以從氣孔、傷口或表皮直接侵入。影響接種試驗的因子包括病原物的致病性和致病力、接種植物的抗病性和感病性和發(fā)病的環(huán)境條件。在接種時,應(yīng)盡量模仿接種菌在自然條件下,侵染寄主時的環(huán)境條件,特別要注意溫度和濕度對接種發(fā)病的影響。學(xué)生在回接后,每隔2~3d觀察病害發(fā)生情況并與自然狀態(tài)比較,等出現(xiàn)顯著癥狀后按上述方法能再次分離到用來回接的病原,否則實驗失敗。

　　5病原鑒定與病因分析

　　(1)病原真菌:以形態(tài)學(xué)特征[4]為主,結(jié)合分子生物學(xué)[5]鑒定種群。

　　(2)病原細(xì)菌:形態(tài)、生理生化結(jié)合分子生物學(xué)[6]鑒定種群。實驗要求學(xué)生根據(jù)優(yōu)勢菌群、回接試驗情況與采樣地環(huán)境狀態(tài)分析發(fā)病因素,寫出實驗報告,并進(jìn)行課程討論。

　　6創(chuàng)新實驗設(shè)計小結(jié)

　　本創(chuàng)新實驗流程簡單總結(jié)為:在采樣及前處理基礎(chǔ)上,完成“分離、接種、再分離”的技術(shù)規(guī)程。

　　(1)分離:從病組織上分離病原物并進(jìn)行純培養(yǎng);(2)接種:用純培養(yǎng)物接種到相同的健康植物上,給予適宜發(fā)病條件,觀察是否引起原來相同的病害;(3)再分離:從接種后發(fā)病的植物上,能分離到與用來接種的病原物。

　　結(jié)束語

　　實驗設(shè)計15學(xué)時,分5階段完成,占森林保護(hù)系列實驗近一半學(xué)時,實驗綜合運用《林木病理學(xué)》、《林木病害研究方法》、《微生物學(xué)》、《分子生物學(xué)技術(shù)》等課程內(nèi)容,屬于我校綜合型實驗、探索型實驗、研究型實驗的代表,是理論基礎(chǔ)與面向林業(yè)生產(chǎn)相結(jié)合的有效形式,這種創(chuàng)新實驗方式應(yīng)是高等農(nóng)業(yè)院校教學(xué)實踐[7-8]的發(fā)展方向。通過該實驗同學(xué)們在實施前主動利用課余、假期社會實踐活動,了解生產(chǎn)中亟待解決的林木病害問題,為實驗設(shè)計開展前期工作,目的性、針對性強。本實驗已實施5年,涉及林學(xué)、園林及觀園專業(yè)學(xué)生。目前有30名學(xué)生的實驗報告作為林木病害診斷書提供給了地方林業(yè)部門作為制定防治方案的決策依據(jù),有15名學(xué)生的實驗論文已正式發(fā)表。學(xué)生在實驗報告和課程討論中總結(jié)到:“人工誘發(fā)診斷技術(shù)是學(xué)好《森林保護(hù)系列實驗》和《林木病理學(xué)》課程的綜合體現(xiàn),通過實驗,不僅提高了自己的實踐操作能力,而且解決了一些生產(chǎn)的實際問題,很有成就感”。作為指導(dǎo)實驗的教師在豐富了教學(xué)內(nèi)容的同時,獲得了更多科學(xué)研究素材,實現(xiàn)了學(xué)與教的雙贏。

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